Isolamento e coltura di cellule ciliate cocleari primarie da topi neonatali
Summary
In questo articolo, presentiamo un protocollo dettagliato per l’isolamento e la coltura di cellule ciliate cocleari primarie dai topi. Inizialmente, l’organo di Corti è stato sezionato da coclee murine neonatali (di 3-5 giorni) al microscopio. Successivamente, le cellule sono state digerite enzimaticamente in una sospensione unicellulare e identificate utilizzando l’immunofluorescenza dopo diversi giorni in coltura.
Abstract
Le cellule ciliate cocleari sono i recettori sensoriali del sistema uditivo. Queste cellule si trovano nell’organo di Corti, l’organo sensoriale responsabile dell’udito, all’interno del labirinto osseo dell’orecchio interno. Le cellule ciliate cocleari sono costituite da due tipi anatomicamente e funzionalmente distinti: cellule ciliate esterne e interne. Il danno a uno di essi provoca la perdita dell’udito. In particolare, poiché le cellule ciliate interne non possono rigenerarsi e il loro danno è permanente. Pertanto, la coltivazione in vitro di cellule ciliate primarie è indispensabile per studiare gli effetti protettivi o rigenerativi delle cellule ciliate cocleari. Questo studio mirava a scoprire un metodo per isolare e coltivare le cellule ciliate di topo.
Dopo la rimozione manuale della parete laterale cocleare, l’epitelio uditivo è stato meticolosamente sezionato dal miolo cocleare al microscopio, incubato in una miscela composta da tripsina-EDTA allo 0,25% per 10 minuti a 37 °C e delicatamente sospeso nel terreno di coltura utilizzando un puntale per pipette da 200 μL. La sospensione cellulare è stata fatta passare attraverso un filtro cellulare, il filtrato è stato centrifugato e le cellule sono state coltivate in piastre a 24 pozzetti. Le cellule ciliate sono state identificate in base alla loro capacità di esprimere un complesso di meccanotrasduzione, la miosina-VIIa, che è coinvolta nelle tensioni motorie, e tramite marcatura selettiva della F-actina utilizzando falloidina. Le cellule hanno raggiunto l’>90% di confluenza dopo 4 giorni in coltura. Questo metodo può migliorare la nostra comprensione delle caratteristiche biologiche delle cellule ciliate coltivate in vitro e dimostrare l’efficienza delle colture di cellule ciliate cocleari, stabilendo una solida base metodologica per ulteriori ricerche uditive.
Introduction
Le cellule ciliate cocleari svolgono un ruolo importante nel rilevamento del suono e nella trasmissione del segnale al nervo uditivo. Le cellule ciliate sono cellule meccanicistiche che funzionano come recettori sensoriali primari e convertono le vibrazioni sonore in segnali elettrici nei vertebrati. L’epitelio sensoriale dell’orecchio interno dei mammiferi comprende una singola fila di cellule ciliate interne e tre file di cellule ciliate esterne. In diverse aree di base della membrana, le cellule ciliate percepiscono i suoni a frequenze diverse (tra 20 e 2.000 Hz)1. La funzione delle cellule ciliate esterne è un processo di amplificazione meccanica attiva che aiuta a mettere a punto l’orecchio interno dei mammiferi, conferendo un’elevata sensibilità al suono. Le cellule ciliate interne sono responsabili del rilevamento dei suoni. Dopo la depolarizzazione graduale, le informazioni acustiche vengono trasmesse al cervello attraverso le fibre nervose uditive2.
La perdita dell’udito può essere causata da difetti genetici, invecchiamento, traumi da rumore o dall’uso eccessivo di farmaci ototossici, che costituiscono un grave problema di salute in tutto il mondo 3,4. La perdita dell’udito deriva principalmente da danni irreversibili alle cellule ciliate5. Per quanto riguarda la perdita dell’udito indotta dal rumore, sebbene i ricercatori abbiano raggiunto un consenso su diversi dettagli della sua eziologia, manca una comprensione completa dei numerosi meccanismi sottostanti. Le cellule ciliate esterne sono particolarmente vulnerabili alla sovraesposizione acustica6. Le cellule ciliate cocleari meccanosensibili sono coinvolte nella perdita dell’udito legata all’età; Tuttavia, i meccanismi molecolari e cellulari alla base della degenerazione delle cellule ciliate rimangono sconosciuti. Diversi cambiamenti nei processi molecolari portano all’invecchiamento delle cellule ciliate, allo stress ossidativo, alla risposta al danno del DNA, all’autofagia e alla disregolazione dell’espressione e della trascrizione dei geni correlati alla specializzazione delle cellule ciliate7.
Poiché l’orecchio interno è racchiuso nell’osso temporale, in profondità nell’osso più duro del corpo, è sperimentalmente inaccessibile, ponendo una sfida alle indagini sui meccanismi di riparazione e rigenerazione delle cellule ciliate. Quindi, la creazione di colture in vitro per studiare la funzione delle cellule ciliate è diventata un metodo ideale per la ricerca sui meccanismi di rigenerazione e lesione dell’orecchio interno. Le procedure per la preparazione di colture organotipiche cocleari sono state descritte in studi precedenti 8,9,10. I ricercatori di tutto il mondo hanno impiegato varie tecniche di microdissezione cocleare e di preparazione della superficie. Nonostante le sfide persistenti, vari sistemi di coltura di cellule ciliate primarie sono stati stabiliti con successo in vitro. Le colture di organi cocleari contengono vari tipi di cellule, tra cui cellule ciliate, cellule di Deiters, cellule di Hensen, cellule pilastro e fibre nervose uditive. Una comprensione approfondita dei cambiamenti nelle cellule ciliate a livello cellulare e molecolare dopo una lesione consentirà lo sviluppo di strumenti di ricerca più potenti. Questo studio mirava a dimostrare i passaggi per isolare gli organi cocleari dai topi neonatali e staccare enzimaticamente le abbondanti cellule ciliate per gli studi in vitro. La natura delle cellule coltivate è stata confermata utilizzando la colorazione in immunofluorescenza.
Protocol
Representative Results
Discussion
Rispetto alla linea cellulare HEI-OC1, le colture primarie di cellule ciliate hanno replicato in modo più accurato lo stato fisiologico delle cellule in vivo. Pertanto, il metodo di coltura primaria uditiva stabilito isolando cellule viventi dagli organi cocleari e coltivandole immediatamente sembra essere uno strumento prezioso per una ricerca approfondita sui sistemi uditivi. Alcune tecniche sono fondamentali per una cultura di successo. In primo luogo, ridurre al minimo la durata della separazione dell’organo di Cort…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (NFSC 82101224 to YG)
Materials
| 100 mm BioLite cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 130182 | using for culture |
| 35 mm Nunc cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 150318 | using for culture |
| 6-well palate | Thermo Fisher Scientific | 310109005 | using for culture |
| 70 µm cell strainers | BD Company | 352350 | using for filter |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | immunofluorescent staining |
| Anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientifc | A11008 | immunofluorescent staining |
| day 3-5 neonatal murine | provided by Xi'an Jiaotong University | ||
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | using for culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | using for culture |
| Forceps | Dumont | 5# | using for dissection |
| Leica anatomy microscope | Germany | S9i | using for dissection |
| Penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | using for culture |
| Rabbit plyclonal to Myosin VIIa | Abcam company | ab92996 | immunofluorescent staining |
| Scissor | Belevor | 10cm/04.0524.10 | using for dissection |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 9036-19-5 | immunofluorescent staining |
| Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25200072 | using for culture |
Referências
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