신생아 마우스의 일차 달팽이관 유모 세포의 분리 및 배양
Summary
여기에서, 우리는 마우스에서 일차 달팽이관 유모 세포를 분리하고 배양하기 위한 상세한 프로토콜을 제시합니다. 처음에는 Corti의 장기를 현미경으로 신생아(3-5일령) 쥐 달팽이관에서 절개했습니다. 이어서, 세포를 효소에 의해 단일세포 현탁액으로 절단하고, 배양에서 며칠 후에 면역형광을 이용하여 확인하였다.
Abstract
달팽이관 유모 세포는 청각 시스템의 감각 수용체입니다. 이 세포는 청각을 담당하는 감각 기관인 코르티(Corti)의 기관에 있으며, 내이의 골미로(osseous labyrinth)에 있습니다. 달팽이관 유모세포는 해부학적으로나 기능적으로 뚜렷한 두 가지 유형, 즉 바깥쪽 유모세포와 내쪽 유모세포로 구성되어 있습니다. 둘 중 하나가 손상되면 청력 손실이 발생합니다. 특히 내부 유모 세포는 재생될 수 없으며 손상은 영구적입니다. 따라서 일차 유모 세포의 체외 배양은 달팽이관 유모 세포의 보호 또는 재생 효과를 조사하는 데 필수적입니다. 이 연구는 쥐의 유모 세포를 분리하고 배양하는 방법을 발견하는 것을 목표로 했습니다.
달팽이관 측벽을 수동으로 제거한 후, 현미경으로 달팽이관에서 청각 상피를 꼼꼼하게 절개하고, 37°C에서 10분 동안 0.25% 트립신-EDTA로 구성된 혼합물에서 배양하고, 200μL 피펫 팁을 사용하여 배양 배지에 부드럽게 현탁시켰습니다. 세포 현탁액을 세포 필터를 통과시키고, 여과액을 원심분리하고, 세포를 24웰 플레이트에서 배양하였다. 유모세포는 운동 장력에 관여하는 메카노트랜스덕션 복합체인 미오신-VIIa를 발현하는 능력과 팔로이딘을 사용한 F-액틴의 선택적 표지를 통해 확인되었습니다. 세포는 배양에서 4 일 후 >90 % 합류에 도달했습니다. 이 방법은 체외 배양 유모 세포의 생물학적 특성에 대한 이해를 높이고 달팽이관 유모 세포 배양의 효율성을 입증하여 추가 청각 연구를 위한 견고한 방법론적 기반을 구축할 수 있습니다.
Introduction
달팽이관 유모 세포는 소리를 감지하고 청각 신경으로 신호를 전달하는 데 중요한 역할을 합니다. 유모 세포는 척추 동물의 주요 감각 수용체로 기능하고 소리 진동을 전기 신호로 변환하는 기계론적 세포입니다. 포유류 내이의 감각 상피는 한 줄의 내부 유모 세포와 세 줄의 외부 유모 세포로 구성됩니다. 서로 다른 기본 막 영역에서 유모 세포는 서로 다른 주파수(20Hz에서 2,000Hz 사이)에서 소리를 감지합니다1. 외부 유모 세포의 기능은 포유류의 내이를 미세 조정하는 데 도움이 되는 능동적인 기계적 증폭 과정으로, 소리에 대한 높은 감도를 부여합니다. 내부 유모 세포는 소리를 감지하는 역할을 합니다. 단계적 탈분극 후, 음향 정보는 청각 신경 섬유를 통해 뇌로 전달된다2.
청력 손실은 유전적 결함, 노화, 소음 외상 또는 이독성 약물의 과도한 사용으로 인해 발생할 수 있으며, 이는 전 세계적으로 주요 건강 문제를 구성합니다 3,4. 난청은 주로 유모세포의 돌이킬 수 없는 손상으로 인해 발생한다5. 소음성 난청과 관련하여, 연구자들은 소음성 난청의 원인에 대한 몇 가지 세부 사항에 대해 합의에 도달했지만, 수많은 근본적인 메커니즘에 대한 포괄적인 이해는 부족합니다. 바깥쪽 유모세포는 특히 음향 과다 노출에 취약하다6. 기계에 민감한 달팽이관 유모 세포는 노화 관련 청력 손실에 관여합니다. 그러나 유모 세포 퇴화의 기저에 있는 분자 및 세포 메커니즘은 아직 밝혀지지 않았습니다. 분자 과정의 여러 변화는 유모세포 노화, 산화 스트레스, DNA 손상 반응, 자가포식, 유모세포 분화와 관련된 유전자의 발현 및 전사 조절 장애를 유발한다7.
내이는 신체의 가장 단단한 뼈 깊숙한 곳인 측두골에 둘러싸여 있기 때문에 실험적으로 접근할 수 없어 유모 세포 복구 및 재생 메커니즘에 대한 조사에 어려움을 겪고 있습니다. 따라서 유모 세포의 기능을 조사하기 위한 체외 배양을 확립하는 것은 내이의 재생 및 손상 메커니즘에 대한 연구에 이상적인 방법이 되었습니다. 달팽이관 기관형 배양을 준비하는 절차는 이전 연구 8,9,10에서 설명되었습니다. 전 세계 연구자들은 다양한 달팽이관 미세해부 및 표면 처리 기술을 사용하고 있습니다. 끊임없는 어려움에도 불구하고 다양한 1차 유모 세포 배양 시스템이 체외에서 성공적으로 확립되었습니다. 달팽이관 장기 배양에는 유모 세포, Deiters 세포, Hensen 세포, 기둥 세포 및 청각 신경 섬유를 포함한 다양한 세포 유형이 포함되어 있습니다. 부상 후 세포 및 분자 수준에서 유모 세포의 변화에 대한 심층적인 이해는 보다 강력한 연구 도구를 개발할 수 있게 할 것입니다. 이 연구는 신생아 마우스에서 달팽이관 기관을 분리하고 체외 연구를 위해 풍부한 유모 세포를 효소로 분리하는 단계를 입증하는 것을 목표로 했습니다. 배양된 세포의 성질은 면역형광 염색을 이용하여 확인하였다.
Protocol
Representative Results
Discussion
HEI-OC1 세포주와 비교했을 때, 유모 세포의 1차 배양은 생체 내 세포의 생리학적 상태를 보다 정확하게 복제했습니다. 따라서 달팽이관 기관에서 살아있는 세포를 분리하고 즉시 배양하여 확립된 청각 1차 배양법은 청각 시스템에 대한 광범위한 연구에 유용한 도구로 보입니다. 특정 기술은 성공적인 문화에 매우 중요합니다. 첫째, 측두골에서 코르티 기관이 분리되는 기간을 최소화하면 유모 세포…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (NFSC 82101224 YG)의 지원을 받았습니다
Materials
| 100 mm BioLite cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 130182 | using for culture |
| 35 mm Nunc cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 150318 | using for culture |
| 6-well palate | Thermo Fisher Scientific | 310109005 | using for culture |
| 70 µm cell strainers | BD Company | 352350 | using for filter |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | immunofluorescent staining |
| Anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientifc | A11008 | immunofluorescent staining |
| day 3-5 neonatal murine | provided by Xi'an Jiaotong University | ||
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | using for culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | using for culture |
| Forceps | Dumont | 5# | using for dissection |
| Leica anatomy microscope | Germany | S9i | using for dissection |
| Penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | using for culture |
| Rabbit plyclonal to Myosin VIIa | Abcam company | ab92996 | immunofluorescent staining |
| Scissor | Belevor | 10cm/04.0524.10 | using for dissection |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 9036-19-5 | immunofluorescent staining |
| Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25200072 | using for culture |
Referências
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