Isolamento e Cultura de Células Ciliadas Cocleares Primárias de Camundongos Neonatais
Summary
Neste trabalho, apresentamos um protocolo detalhado para isolamento e cultivo de células ciliadas primárias da cóclea de camundongos. Inicialmente, o órgão de Corti foi dissecado de cócleas murinas neonatais (idade 3-5 dias) sob um microscópio. Posteriormente, as células foram digeridas enzimaticamente em uma suspensão unicelular e identificadas por imunofluorescência após vários dias em cultura.
Abstract
As células ciliadas da cóclea são os receptores sensoriais do sistema auditivo. Essas células estão localizadas no órgão de Corti, órgão sensorial responsável pela audição, dentro do labirinto ósseo da orelha interna. As células ciliadas da cóclea consistem em dois tipos anatomicamente e funcionalmente distintos: células ciliadas externas e internas. Danos a qualquer um deles resultam em perda auditiva. Notavelmente, como as células ciliadas internas não podem se regenerar, e os danos a elas são permanentes. Assim, o cultivo in vitro de células ciliadas primárias é indispensável para investigar os efeitos protetores ou regenerativos das células ciliadas da cóclea. Este estudo teve como objetivo descobrir um método para isolar e cultivar células ciliadas de camundongos.
Após a remoção manual da parede lateral da cóclea, o epitélio auditivo foi meticulosamente dissecado do modíolo coclear ao microscópio, incubado em uma mistura composta de tripsina-EDTA a 0,25% por 10 min a 37 °C e suavemente suspenso em meio de cultura com ponta de pipeta de 200 μL. A suspensão celular foi passada através de um filtro de células, o filtrado foi centrifugado e as células foram cultivadas em placas de 24 poços. As células ciliadas foram identificadas com base em sua capacidade de expressar um complexo mecanotransdutor, a miosina-VIIa, que está envolvido em tensões motoras, e via marcação seletiva de F-actina usando faloidina. As células atingiram >90% de confluência após 4 dias em cultura. Este método pode melhorar nossa compreensão das características biológicas de células ciliadas cultivadas in vitro e demonstrar a eficiência das culturas de células ciliadas cocleares, estabelecendo uma base metodológica sólida para futuras pesquisas auditivas.
Introduction
As células ciliadas da cóclea desempenham papéis importantes na detecção do som e na transmissão do sinal para o nervo auditivo. As células ciliadas são células mecanicistas que funcionam como receptores sensoriais primários e convertem vibrações sonoras em sinais elétricos em vertebrados. O epitélio sensorial da orelha interna de mamíferos é composto por uma única fileira de células ciliadas internas e três fileiras de células ciliadas externas. Em diferentes áreas da membrana básica, as células ciliadas percebem sons em diferentes frequências (entre 20 e 2.000 Hz)1. A função das células ciliadas externas é um processo de amplificação mecânica ativa que ajuda a ajustar o ouvido interno dos mamíferos, conferindo alta sensibilidade ao som. As células ciliadas internas são responsáveis pela detecção de sons. Após a despolarização gradual, a informação acústica é transmitida ao cérebro através das fibras do nervoauditivo2.
A perda auditiva pode ser causada por defeitos genéticos, envelhecimento, trauma sonoro ou uso excessivo de drogas ototóxicas, que constituem um grande problema de saúde em todo omundo3,4. A perda auditiva resulta, principalmente, de danos irreversíveis às células ciliadas5. Em relação à perda auditiva induzida por ruído, embora os pesquisadores tenham chegado a um consenso sobre vários detalhes de sua etiologia, falta uma compreensão abrangente dos inúmeros mecanismos subjacentes. As células ciliadas externas são particularmente vulneráveis à superexposição acústica6. As células ciliadas mecanossensíveis da cóclea estão envolvidas na perda auditiva relacionada à idade; no entanto, os mecanismos moleculares e celulares subjacentes à degeneração das células ciliadas permanecem desconhecidos. Diversas alterações nos processos moleculares levam ao envelhecimento das células ciliadas, estresse oxidativo, resposta a danos ao DNA, autofagia e desregulação da expressão e transcrição de genes relacionados à especialização das células ciliadas7.
Como a orelha interna está envolta no osso temporal, profundamente no osso mais duro do corpo, ela é experimentalmente inacessível, representando um desafio para as investigações sobre os mecanismos de reparação e regeneração das células ciliadas. Assim, o estabelecimento de culturas in vitro para investigação da função das células ciliadas tornou-se um método ideal para pesquisas sobre os mecanismos de regeneração e lesão da orelha interna. Os procedimentos de preparo das culturas organotípicas da cóclea foram descritos em estudos anteriores 8,9,10. Pesquisadores em todo o mundo têm empregado várias técnicas de microdissecção coclear e preparação de superfície. Apesar dos desafios persistentes, vários sistemas primários de cultura de células ciliadas foram estabelecidos com sucesso in vitro. As culturas de órgãos cocleares contêm vários tipos de células, incluindo células ciliadas, células de Deiters, células de Hensen, células pilares e fibras do nervo auditivo. Uma compreensão profunda das mudanças nas células ciliadas em nível celular e molecular após a lesão permitirá o desenvolvimento de ferramentas de pesquisa mais poderosas. Este estudo teve como objetivo demonstrar os passos para isolar órgãos cocleares de camundongos neonatais e desprender enzimaticamente as células ciliadas abundantes para estudos in vitro. A natureza das células cultivadas foi confirmada pela coloração de imunofluorescência.
Protocol
Representative Results
Discussion
Em comparação com a linhagem celular HEI-OC1, culturas primárias de células ciliadas replicaram com mais precisão o estado fisiológico das células in vivo. Portanto, o método de cultura primária auditiva estabelecido pelo isolamento de células vivas dos órgãos cocleares e sua cultura imediata parece ser uma ferramenta valiosa para uma extensa pesquisa sobre sistemas auditivos. Certas técnicas são cruciais para uma cultura de sucesso. Primeiro, minimizar a duração da separação do órgão de Corti do osso…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela National Natural Science Foundation of China (NFSC 82101224 à YG)
Materials
| 100 mm BioLite cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 130182 | using for culture |
| 35 mm Nunc cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 150318 | using for culture |
| 6-well palate | Thermo Fisher Scientific | 310109005 | using for culture |
| 70 µm cell strainers | BD Company | 352350 | using for filter |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | immunofluorescent staining |
| Anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientifc | A11008 | immunofluorescent staining |
| day 3-5 neonatal murine | provided by Xi'an Jiaotong University | ||
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | using for culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | using for culture |
| Forceps | Dumont | 5# | using for dissection |
| Leica anatomy microscope | Germany | S9i | using for dissection |
| Penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | using for culture |
| Rabbit plyclonal to Myosin VIIa | Abcam company | ab92996 | immunofluorescent staining |
| Scissor | Belevor | 10cm/04.0524.10 | using for dissection |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 9036-19-5 | immunofluorescent staining |
| Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25200072 | using for culture |
Referências
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