Een efficiënte en reproduceerbare methode voor het produceren van samengestelde planten door Agrobacterium rhizogenes-gebaseerde harige worteltransformatie
Summary
Hier bieden we het gedetailleerde protocol van een transformatiemethode in één stap, gemedieerd door Agrobacterium tumefaciens om samengestelde planten te produceren.
Abstract
Het produceren van samengestelde planten met transgene wortels en niet-transgene stengels en knoppen met behulp van Agrobacterium rhizogenes-gemedieerde harige worteltransformatie is een krachtig hulpmiddel om wortelgerelateerde biologie te bestuderen. Harige worteltransformatie wordt vastgesteld in een breed scala van tweezaadlobbigen en in verschillende eenzaadlobbige soorten en is bijna onafhankelijk van het genotype. De traditionele methode van hypocotylinjectie met A. rhizogenes om samengestelde planten te verkrijgen is inefficiënt, tijdrovend, arbeidsintensief en veroorzaakt vaak de dood van zachte en kleine hypocotylplanten. Een zeer efficiënte, eenstaps harige worteltransformatie gemedieerd door A. rhizogenes werd eerder vastgesteld, waardoor de noodzaak voor transplantatie na het produceren van harige wortels wordt geëlimineerd. In deze studie werden een gedeeltelijke hypocotyl en primaire wortel verwijderd, de hypocotylincisieplaats werd bedekt met A. rhizogenes en vervolgens werden hypocotylen geplant in steriel vermiculiet. Na 12 dagen van de teelt breidde de hypocotylincisie zich uit en werden nieuwe harige wortels geïnduceerd. Dit artikel biedt het gedetailleerde protocol van een transformatiemethode in één stap, gemedieerd door A. rhizogenes, waarvan de effectiviteit wordt aangetoond door samengestelde planten van wilde sojabonen, Solanum americanum en pompoen te produceren.
Introduction
Agrobacterium rhizogenes is een gramnegatieve bodembacterie uit de familie Rhizobiaceae. A. rhizogenes kan bijna alle tweezaadlobbigen, een paar eenzaadlobbigen en individuele gymnospermen via wonden infecteren en harige wortels in geïnfecteerde planten produceren. De bacterie draagt het Ri (wortel-inducerend) plasmide en het T-DNA van het Ri-plasmide draagt het opinesynthesegen en rolgenen (wortellocusgenen). Nadat het T-DNA van het Ri-plasmide een plantencel binnendringt en is geïntegreerd in een gastheerchromosoom, induceert de expressie van de rolgenen de productie van harige wortels1. Een plant binaire expressievector met een doelgen wordt omgezet in A. rhizogenes en de getransformeerde A. rhizogenes wordt gebruikt om een plant te infecteren. Transgene wortels kunnen worden geïnduceerd in geïnfecteerde planten, waardoor samengestelde planten worden geproduceerd die transgene wortels en niet-transgene stengels en knoppen bevatten. Over het algemeen kan een samengestelde plant binnen 14-20 dagen worden verkregen. A. rhizogenes-gemedieerde harige worteltransformatie wordt over het algemeen niet beperkt door genotype in tweezaadlobbige planten2. De harige wortels geproduceerd door A. rhizogenes-geïnfecteerde planten worden gekenmerkt door een snelle groeisnelheid, stabiele overerving en eenvoudige bediening. Harige worteltransformatie gemedieerd door A. rhizogenes wordt momenteel veel gebruikt om wortelgerelateerde biologie te bestuderen. Bovendien kan de transformatie van harige wortels ook worden gebruikt om de doelbewerkingsefficiëntie van het CRISPR / Cas9-systeem 3,4,5 en eiwitsubcellulaire lokalisatie te valideren en te optimaliseren. Daarom is harige worteltransformatie een belangrijk hulpmiddel bij onderzoek naar de genfunctie van planten, metabole engineering en interacties tussen wortels en rhizosfeermicro-organismen 6,7,8.
Samengestelde planten die transgene wortels bevatten die zijn verkregen door harige worteltransformatie, zijn op grote schaal geproduceerd in tweezaadlobbige planten, vooral in peulvruchten. De traditionele methode om de hypocotyl te injecteren met A. rhizogenes is gebruikt om composiet Lotus corniculatus9, sojabonen 10, tomaat11, zoete aardappelen12 en vele andere planten 5,8 te produceren. De hypocotyl-injectiemethode is inefficiënt en veroorzaakt waarschijnlijk de dood van jonge of kleine hypocotylplanten. Daarom werd de methode verbeterd door de embryonale wortels af te snijden, de zaailingincisie te bedekken met A. rhizogenes en vervolgens het hypocotyl op steriel kweekmedium te plaatsen voor bewortelingsteelt13. Die stappen worden echter uitgevoerd in een steriele omgeving en de bedieningsstappen zijn relatief omslachtig. In het bijzonder moeten de resulterende samengestelde planten worden getransplanteerd, wat de hoeveelheid werk verhoogt. In eerder werk werd eenstaps A. rhizogenes-gemedieerde (ARM) harige worteltransformatie vastgesteld in komkommer, sojabonen, Lotus japonicus, Medicago truncatula en tomaat 2,14,15,16,17. De primaire wortel en gedeeltelijke hypocotyl werden verwijderd, de incisieplaats van de resterende hypocotyl werd bedekt met getransformeerde A. rhizogenes en de zaailing werd vervolgens geplant in vochtig steriel vermiculiet. Na 12 dagen van de teelt werden harige wortels geproduceerd op de incisieplaats. De eenstaps ARM-methode is zeer efficiënt en vereist minder tijd om harige wortels te produceren. Verplanten na het vormen van harige wortels is ook niet nodig. Omdat microbiële besmetting kan worden vermeden zonder transplantatie, kan de eenstaps ARM-methode bijzonder nuttig zijn bij het bestuderen van interacties tussen planten en micro-organismen, zoals symbiotische stikstoffixatie tussen vlinderbloemige planten en Rhizobia, en symbiose tussen planten en arbusculaire mycorrhizaschimmels. In dit artikel wordt een gedetailleerd één-stap A. rhizogenes-gemedieerd harig worteltransformatieprotocol gegeven met voorbeelden van samengestelde planten geproduceerd in wilde sojabonen, Solanum americanum en pompoen. Met het protocol kunnen onderzoekers de armtransformatie in één stap soepel uitvoeren.
Protocol
Representative Results
Discussion
De eenstaps A. rhizogenes-gemedieerde harige wortelmethode is een eenvoudigere en efficiëntere methode voor het produceren van samengestelde planten dan de hypocotyl-injectiemethode. De ARM-methode in één stap verbetert de efficiëntie van harige worteltransformatie aanzienlijk, verkort de tijd om harige wortels te produceren, verhoogt het aantal harige wortels en vermindert de hoeveelheid werk die ermee gemoeid is. Het verbeterde transformatieprotocol is optimaal voor studies naar symbiose tussen vlinderbloe…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door het Onderzoeksfonds van de Liaocheng Universiteit (318012028) en de Natural Science Foundation van de provincie Shandong (ZR2020MC034).
Materials
| kanamycin | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A506636 | |
| LB medium | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | B540113 | |
| plastic box | LiaoSu | 8 cm x 11 cm x 9 cm | |
| pumpkin | local variety Yinsu | ||
| streptomycin | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A610494 | |
| Tanon-5200Multi machine | Tanon Co., Ltd., China | 5200Multi | chemiluminescence imaging system |
| tomato | local variety Zhongshu4 | ||
| wild soybean | collected in Yanggu County, Liaocheng, China |
Referências
- Chilton, M. D., et al. Agrobacterium rhizogenes inserts T-DNA into the genome of the host plant root cells. Nature. 295, 432-434 (1982).
- Fan, Y., et al. A fast, simple, high efficient and one-step generation of composite cucumber plants with transgenic roots by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC). 141, 207-216 (2020).
- Du, H., et al. Efficient targeted mutagenesis in soybean by TALENs and CRISPR/Cas9. Journal of Biotechnology. 217, 90-97 (2016).
- Nguyen, D. V., et al. An efficient hairy root system for validation of plant transformation vector and CRISPR/Cas construct activities in cucumber (Cucumis sativus L.). Frontiers in Plant Science. 12, 770062 (2022).
- Liu, S., et al. AtGCS promoter-driven clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9 highly efficiently generates homozygous/biallelic mutations in the transformed roots by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. Frontiers in Plant Science. 13, 952428 (2022).
- Irigoyen, S., et al. Plant hairy roots enable high throughput identification of antimicrobials against Candidatus Liberibacter spp. Nature Communications. 11 (1), 5802 (2020).
- Plasencia, A., et al. Eucalyptus hairy roots, a fast, efficient and versatile tool to explore function and expression of genes involved in wood formation. Plant Biotechnology Journal. 14 (6), 1381-1393 (2016).
- Gutierrez-Valdes, N., et al. Hairy root cultures-a versatile tool with multiple applications. Frontiers in Plant Science. 11, 33 (2020).
- Stougaard, J. Agrobacterium rhizogenes as a vector for transforming higher plants. Application in Lotus corniculatus transformation. Methods in Molecular Biology. 49, 49-61 (1995).
- Kereszt, A., et al. Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of soybean to study root biology. Nature Protocols. 2 (4), 948-952 (2007).
- Ho-Plágaro, T., Huertas, R., Tamayo-Navarrete, M. I., Ocampo, J. A., García-Garrido, J. M. An improved method for Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of tomato suitable for the study of arbuscular mycorrhizal symbiosis. Plant Methods. 14, 34 (2018).
- Yu, Y., et al. Overexpression of phosphatidylserine synthase IbPSS1 affords cellular Na+ homeostasis and salt tolerance by activating plasma membrane Na+/H+ antiport activity in sweet potato roots. Horticulture Research. 7, 131 (2020).
- Boisson-Dernier, A., et al. Agrobacterium rhizogenes-transformed roots of Medicago truncatula for the study of nitrogen-fixing and endomycorrhizal symbiotic associations. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 14 (6), 695-700 (2001).
- Fan, Y., et al. One-step generation of composite soybean plants with transgenic roots by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. BMC Plant Biology. 20 (1), 208 (2020).
- Fan, Y., et al. Anthocyanin, a novel and user-friendly reporter for convenient, non-destructive, low cost, directly visual selection of transgenic hairy roots in the study of rhizobia-legume symbiosis. Plant Methods. 16, 94 (2020).
- Wang, X., et al. Application of AtMYB75 as a reporter gene in the study of symbiosis between tomato and Funneliformis mosseae. Mycorrhiza. 33 (3), 181-185 (2023).
- Wang, X., et al. Development of a set of novel binary expression vectors for plant gene function analysis and genetic transformation. Frontiers in Plant Science. 13, 1104905 (2023).
- Li, Q. Q., et al. Phytochrome B inhibits darkness-induced hypocotyl adventitious root formation by stabilizing IAA14 and suppressing ARF7 and ARF19. The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 105 (6), 1689-1702 (2021).
