כאן, אנו מספקים את הפרוטוקול המפורט של שיטת טרנספורמציה חד-שלבית בתיווך Agrobacterium tumefaciens לייצור צמחים מרוכבים.
ייצור צמחים מרוכבים עם שורשים טרנסגניים וגבעולים וניצנים שאינם מהונדסים באמצעות טרנספורמציית שורשים שעירים בתיווך אגרובקטריום הוא כלי רב עוצמה לחקר ביולוגיה הקשורה לשורשים. טרנספורמציית שורשים שעירים מתבססת במגוון רחב של דיקוטילדונים ובמספר מיני מונוקוטילדונים והיא כמעט בלתי תלויה בגנוטיפ. השיטה המסורתית של הזרקת היפוקוטיל עם קנה שורש A . להשגת צמחים מרוכבים אינה יעילה, גוזלת זמן, מייגעת, ולעתים קרובות גורמת למוות של צמחי היפוקוטיל רכים וזעירים. בעבר הוקמה טרנספורמציה יעילה ביותר, חד-שלבית, של שורש שעיר בתיווך A. rhizogenes , אשר מבטלת את הצורך בהשתלה לאחר ייצור שורשים שעירים. במחקר זה הוסרו היפוקוטיל חלקי ושורש ראשוני, אתר חתך ההיפוקוטיל היה מצופה בקנה-שורש A, ולאחר מכן נשתלו היפוקוטיל בוורמיקוליט סטרילי. לאחר 12 ימי טיפוח, חתך ההיפוקוטיל התרחב והושרו שורשים שעירים חדשים. מאמר זה מספק את הפרוטוקול המפורט של שיטת טרנספורמציה חד-שלבית בתיווך A. rhizogenes, כאשר יעילותה הודגמה על ידי ייצור צמחים מרוכבים של סויה בר, Solanum americanum ודלעת.
Agrobacterium rhizogenes הוא חיידק קרקע גראם-שלילי ממשפחת Rhizobiaceae. A. rhizogenes יכול להדביק כמעט את כל dicotyledons, כמה monocotyledons, ואת gymnosperms בודדים דרך פצעים, לייצר שורשים שעירים בצמחים נגועים. החיידק נושא את פלסמיד Ri (השראת שורש), וה-T-DNA של פלסמיד Ri נושא את הגן הסינתזה opine ואת הגנים rol (גנים לוקוס שורש). לאחר שה-T-DNA של פלסמיד Ri נכנס לתא צמח ומשולב בכרומוזום מארח, ביטוי הגנים של הרול גורם לייצור שורשים שעירים1. וקטור ביטוי בינארי של צמח הנושא גן מטרה הופך לקנה שורש A, וקנה השורש A. שעבר טרנספורמציה משמש להדבקת צמח. שורשים טרנסגניים יכולים להיות מושרים בצמחים נגועים, לייצר צמחים מרוכבים המכילים שורשים טרנסגניים וגבעולים וניצנים שאינם מהונדסים . בדרך כלל, צמח מורכב ניתן להשיג בתוך 14-20 ימים. A. שינוי שורש שעיר בתיווך קנה שורש אינו מוגבל בדרך כלל על ידי גנוטיפ בצמחים dicotyledonous2. השורשים השעירים המיוצרים על ידי צמחים נגועים בריזוגנים מאופיינים בקצב צמיחה מהיר, תורשה יציבה ותפעול קל. טרנספורמציה של שורשים שעירים בתיווך A. rhizogenes נמצאת כיום בשימוש נרחב לחקר ביולוגיה הקשורה לשורשים. יתר על כן, ניתן להשתמש בטרנספורמציה של שורשים שעירים גם כדי לאמת ולמטב את יעילות עריכת המטרותשל מערכת CRISPR/Cas9 3,4,5 ולוקליזציה תת-תאית של חלבונים. לכן, טרנספורמציה של שורשים שעירים היא כלי חשוב במחקר על תפקוד גנים של צמחים, הנדסה מטבולית ואינטראקציות בין שורשים למיקרואורגניזמים בריזוספרה 6,7,8.
צמחים מרוכבים המכילים שורשים טרנסגניים המתקבלים באמצעות טרנספורמציה של שורשים שעירים הופקו באופן נרחב בצמחים דיקוטילדוניים, במיוחד בקטניות. השיטה המסורתית של הזרקת hypocotyl עם קנה שורש A. שימש לייצור מרוכב Lotus corniculatus9, פולי סויה10, עגבניות 11, בטטות12, וצמחים רבים אחרים 5,8. שיטת הזרקת ההיפוקוטיל אינה יעילה ועלולה לגרום למוות של צמחי היפוקוטיל צעירים או זעירים. לכן, השיטה שופרה על ידי חיתוך שורשי העובר, ציפוי חתך השתיל עם A. rhizogenes, ולאחר מכן הנחת hypocotyl על מדיום תרבית סטרילית עבור השתרשות טיפוח13. עם זאת, שלבים אלה מבוצעים בסביבה סטרילית, ושלבי הניתוח מסורבלים יחסית. בפרט, צמחים מרוכבים וכתוצאה מכך צריך להיות מושתל, אשר מגדיל את כמות העבודה. בעבודה קודמת נקבעה טרנספורמציה של שורש שעיר בתיווך A. rhizogenes (ARM) במלפפון, סויה, לוטוס japonicus, Medicago truncatula, ועגבניות 2,14,15,16,17. השורש הראשוני וההיפוקוטיל החלקי הוסרו, אתר החתך של ההיפוקוטיל הנותר היה מצופה בקנה-שורש A. שעבר טרנספורמציה, והשתיל הושתל לתוך ורמיקוליט סטרילי לח. לאחר 12 ימי גידול, שורשים שעירים הופקו באתר החתך. שיטת ARM החד-שלבית יעילה ביותר ודורשת פחות זמן לייצר שורשים שעירים. השתלה לאחר יצירת שורשים שעירים הוא גם לא הכרחי. מאחר שניתן להימנע מזיהום מיקרוביאלי ללא השתלה, שיטת ARM החד-שלבית יכולה להיות שימושית במיוחד כאשר חוקרים אינטראקציות בין צמחים ומיקרואורגניזמים, כגון קיבוע חנקן סימביוטי בין צמחים קטומים לריזוביה, וסימביוזה בין צמחים ופטריות מיקוריזה ארבוסקולריות. במאמר זה, פרוטוקול טרנספורמציה מפורט של שורש שעיר בתיווך A. rhizogenes מספק דוגמאות של צמחים מרוכבים המיוצרים בפולי סויה בר, Solanum americanum ודלעת. בעזרת הפרוטוקול, חוקרים יכולים לבצע בצורה חלקה את טרנספורמציית ARM בצעד אחד.
שיטת השורש השעיר בתיווך קנה שורש A. היא שיטה פשוטה ויעילה יותר לייצור צמחים מרוכבים מאשר שיטת הזרקת היפוקוטיל. שיטת ARM החד-שלבית משפרת משמעותית את יעילות טרנספורמציית השורשים השעירים, מקצרת את זמן ייצור השורשים השעירים, מגדילה את מספר השורשים השעירים ומפחיתה את כמות העבודה הכרוכה בכך….
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי קרן המחקר של אוניברסיטת ליאוצ’נג (318012028) והקרן למדעי הטבע של פרובינציית שאנדונג (ZR2020MC034).
kanamycin | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A506636 | |
LB medium | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | B540113 | |
plastic box | LiaoSu | 8 cm x 11 cm x 9 cm | |
pumpkin | local variety Yinsu | ||
streptomycin | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A610494 | |
Tanon-5200Multi machine | Tanon Co., Ltd., China | 5200Multi | chemiluminescence imaging system |
tomato | local variety Zhongshu4 | ||
wild soybean | collected in Yanggu County, Liaocheng, China |