Un metodo efficiente e riproducibile per la produzione di piante composite mediante trasformazione delle radici pelose a base di Agrobacterium rhizogenes
Summary
Qui, forniamo il protocollo dettagliato di un metodo di trasformazione in un’unica fase mediato da Agrobacterium tumefaciens per produrre piante composite.
Abstract
La produzione di piante composite con radici transgeniche e steli e gemme non transgenici utilizzando la trasformazione delle radici pelose mediata da Agrobacterium rhizogenes è un potente strumento per studiare la biologia correlata alle radici. La trasformazione della radice pelosa è stabilita in una vasta gamma di dicotiledoni e in diverse specie di monocotiledoni ed è quasi indipendente dal genotipo. Il metodo tradizionale di iniezione di ipocotile con A. rhizogenes per ottenere piante composite è inefficiente, richiede tempo, laborioso e spesso causa la morte di piante ipocotiliche tenere e minuscole. In precedenza è stata stabilita una trasformazione delle radici pelose in un solo passaggio altamente efficiente, mediata da A. rhizogenes , che elimina la necessità di trapianto dopo aver prodotto radici pelose. In questo studio, un ipocotile parziale e la radice primaria sono stati rimossi, il sito di incisione ipocotilicica è stato rivestito con A. rhizogenes, e quindi gli ipocotili sono stati piantati in vermiculite sterile. Dopo 12 giorni di coltivazione, l’incisione ipocotilicica si è espansa e sono state indotte nuove radici pelose. Questo articolo fornisce il protocollo dettagliato di un metodo di trasformazione in un’unica fase mediato da A. rhizogenes, con la sua efficacia dimostrata dalla produzione di piante composite di soia selvatica, Solanum americanum e zucca.
Introduction
Agrobacterium rhizogenes è un batterio del suolo gram-negativo della famiglia Rhizobiaceae. A. rhizogenes può infettare quasi tutte le dicotiledoni, alcune monocotiledoni e singole gimnosperme attraverso le ferite, producendo radici pelose nelle piante infette. Il batterio trasporta il plasmide Ri (che induce la radice) e il T-DNA del plasmide Ri trasporta il gene di sintesi dell’opina e i geni rol (geni del locus radicale). Dopo che il T-DNA del plasmide Ri entra in una cellula vegetale ed è integrato in un cromosoma ospite, l’espressione dei geni rol induce la produzione di radici pelose1. Un vettore di espressione binaria vegetale che trasporta un gene bersaglio viene trasformato in A. rhizogenes e l’A. rhizogenes trasformato viene utilizzato per infettare una pianta. Le radici transgeniche possono essere indotte nelle piante infette, producendo piante composite contenenti radici transgeniche e steli e gemme non transgenici. Generalmente, una pianta composita può essere ottenuta entro 14-20 giorni. A. La trasformazione delle radici pelose mediata da rizogeni non è generalmente limitata dal genotipo nelle piante dicotiledoni2. Le radici pelose prodotte da piante infette da A. rhizogenes sono caratterizzate da un rapido tasso di crescita, ereditarietà stabile e facilità d’uso. La trasformazione della radice pelosa mediata da A. rhizogenes è attualmente ampiamente utilizzata per studiare la biologia correlata alle radici. Inoltre, la trasformazione delle radici pelose può anche essere utilizzata per convalidare e ottimizzare l’efficienza di target-editing del sistema CRISPR/Cas9 3,4,5 e la localizzazione subcellulare delle proteine. Pertanto, la trasformazione delle radici pelose è uno strumento importante nella ricerca sulla funzione genica delle piante, sull’ingegneria metabolica e sulle interazioni tra radici e microrganismi della rizosfera 6,7,8.
Le piante composite contenenti radici transgeniche ottenute attraverso la trasformazione delle radici pelose sono state ampiamente prodotte nelle piante dicotiledoni, specialmente nei legumi. Il metodo tradizionale di iniezione dell’ipocotile con A. rhizogenes è stato utilizzato per produrre Lotus corniculatus 9, soia 10, pomodoro11, patate dolci12 e molte altre piante 5,8. Il metodo di iniezione di ipocotile è inefficiente ed è probabile che causi la morte di piante ipocotiliche giovani o minuscole. Pertanto, il metodo è stato migliorato tagliando le radici embrionali, rivestendo l’incisione della piantina con A. rhizogenes e quindi posizionando l’ipocotile su terreno di coltura sterile per la coltivazione del radicamento13. Tuttavia, questi passaggi vengono eseguiti in un ambiente sterile e le fasi operative sono relativamente ingombranti. In particolare, le piante composite risultanti devono essere trapiantate, il che aumenta la quantità di lavoro. Nel lavoro precedente, la trasformazione della radice pelosa mediata da A. rhizogenes (ARM) è stata stabilita in cetriolo, soia, Lotus japonicus, Medicago truncatula e pomodoro 2,14,15,16,17. La radice primaria e l’ipocotile parziale sono stati rimossi, il sito di incisione dell’ipocotile rimanente è stato rivestito con A. rhizogenes trasformato e la piantina è stata quindi piantata in vermiculite sterile umida. Dopo 12 giorni di coltivazione, le radici pelose sono state prodotte nel sito di incisione. Il metodo ARM one-step è altamente efficiente e richiede meno tempo per produrre radici pelose. Anche il trapianto dopo aver formato radici pelose non è necessario. Poiché la contaminazione microbica può essere evitata senza trapianto, il metodo ARM in un’unica fase può essere particolarmente utile quando si studiano le interazioni tra piante e microrganismi, come la fissazione simbiotica dell’azoto tra leguminose e rizobia e le simbiosi tra piante e funghi micorrizici arbuscolari. In questo articolo, viene fornito un dettagliato protocollo di trasformazione delle radici pelose mediato da A. rhizogenes con esempi di piante composite prodotte in soia selvatica, Solanum americanum e zucca. Con il protocollo, i ricercatori possono eseguire senza problemi la trasformazione ARM in un solo passaggio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo della radice pelosa mediata da A. rhizogenes è un metodo più semplice ed efficiente per la produzione di piante composite rispetto al metodo di iniezione ipocotile. Il metodo ARM in un’unica fase migliora significativamente l’efficienza della trasformazione delle radici pelose, riduce il tempo per produrre radici pelose, aumenta il numero di radici pelose e riduce la quantità di lavoro coinvolto. Il protocollo di trasformazione migliorato è ottimale per studi sulle simbiosi tra leguminose e rizobie…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal Fondo di ricerca dell’Università di Liaocheng (318012028) e dalla Fondazione di Scienze Naturali della Provincia di Shandong (ZR2020MC034).
Materials
| kanamycin | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A506636 | |
| LB medium | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | B540113 | |
| plastic box | LiaoSu | 8 cm x 11 cm x 9 cm | |
| pumpkin | local variety Yinsu | ||
| streptomycin | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A610494 | |
| Tanon-5200Multi machine | Tanon Co., Ltd., China | 5200Multi | chemiluminescence imaging system |
| tomato | local variety Zhongshu4 | ||
| wild soybean | collected in Yanggu County, Liaocheng, China |
Referências
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