유도만능줄기세포(Induced Pluripotent Stem Cells)에서 현탁액의 신장 오가노이드 생성
Summary
이 프로토콜은 현탁 배양 조건을 사용하여 유도만능줄기세포(iPSC)에서 신장 오가노이드를 생산하기 위한 포괄적이고 효율적인 방법을 제시합니다. 이 연구의 주요 초점은 초기 세포 밀도와 WNT 작용제 농도의 결정에 있어 신장 오가노이드 연구에 관심이 있는 연구자에게 도움이 됩니다.
Abstract
신장 오가노이드는 다양한 접근법을 통해 유도만능줄기세포(iPSC)에서 생성할 수 있습니다. 이러한 오가노이드는 질병 모델링, 약물 스크리닝 및 잠재적인 치료 응용 분야에 큰 가능성을 가지고 있습니다. 이 글에서는 iPSC에서 신장 오가노이드를 생성하는 단계별 절차를 제시하며, 이는 PS(Posterior Primitive Streak)에서 시작하여 중간 중배엽(IM)까지 이어집니다. 이 접근법은 동물성 성분이 없는 정의된 배지인 APEL 2 배지에 의존합니다. 4일 동안 고농도의 WNT 작용제(CHIR99021)를 보충한 후 섬유아세포 성장 인자 9(FGF9)/헤파린과 저농도 CHIR99021를 추가로 3일 동안 보충합니다. 이 과정에서는 성공적인 신장 오가노이드 생성에 매우 중요하기 때문에 iPSC를 시작할 때 최적의 세포 밀도와 CHIR99021 농도를 선택하는 데 중점을 둡니다. 이 프로토콜의 중요한 측면은 낮은 점착 플레이트의 현탁 배양으로, IM이 사구체, 근위 관형 및 원위 관형 구조를 포함하는 네프론 구조로 점진적으로 발전할 수 있도록 하며, 모두 시각적으로 이해할 수 있는 형식으로 제공됩니다. 전반적으로, 이 상세한 프로토콜은 다양한 iPSC에서 신장 오가노이드를 생성하는 효율적이고 구체적인 기술을 제공하여 성공적이고 일관된 결과를 보장합니다.
Introduction
신장은 기능 단위에 따라 생리적 항상성을 유지하는 데 중요한 역할을 합니다. 노폐물을 배출하는 네프론은 체액의 구성을 조절할 수 있습니다. 유전적 돌연변이 또는 기타 고위험 요인에 의해 발생하는 만성 신장 질환(CKD)은 결국 말기 신장 질환(ESKD)으로 진행됩니다1,2. ESKD는 네프론의 재생 능력이 제한되어 있기 때문인 것으로 보인다. 따라서 신대체 요법이 필요합니다. 인간 iPSC의 유도 분화는 신장 발달을 연구하고, 환자별 질병을 모델링하고, 신독성 약물 스크리닝을 수행하는 데 사용할 수 있는 환자별 3D 신장 오가노이드의 체외 생성을 가능하게 합니다 3,4.
배아 발달 과정에서 신장은 원시 줄무늬(PS)와 구별되는 중간 중배엽(IM)에서 유래합니다. 고전적인 WNT 신호전달 경로는 FGF(FGF9, FGF20) 및 BMP(JNK를 통한 Bmp7 신호전달)5,6,7의 조정된 참여로 IM의 추가적인 분화를 유도할 수 있다. 그들은 신장 전구 세포 (NPC)의 두 가지 중요한 세포 집단을 생산합니다 : 요관 새싹 (UB)과 메타 네프릭 중간엽 (MM)은 각각 수집 덕트와 네프론을 형성합니다 8,9. 각 네프론은 근위 세뇨관 및 원위 세뇨관과 같은 사구체 및 세뇨관 세그먼트와 Henle10,11의 고리로 구성됩니다. 위에서 언급한 이론에 따르면, 현재 발표된 프로토콜은 신장 오가노이드를 유도하기 위해 신호 캐스케이드 및 성장 인자 자극을 모방합니다 5,12.
지난 몇 년 동안 인간 iPSC를 신장 오가노이드 5,6,7,12로 분화하기 위한 많은 프로토콜이 개발되었습니다. Takasato et al.7은 FGF9로 대체하기 전에 CHIR(WNT 작용제) 치료 기간을 최적화했습니다. 프로토콜에 따르면 4일 동안 CHIR에 노출된 후 3일 동안 FGF9에 노출되는 것이 iPSC에서 IM을 유도하는 가장 효과적인 방법입니다. 트랜스웰 필터는 절차에서 배양 형식으로 활용되었습니다. 그러나 이 방법은 초보자에게는 어렵습니다. 따라서 Kumar et al.13은 문화권 형식을 변경하려고 시도하고 문화권을 일시 중단하기로 결정했습니다. 그들은 7일째에 부착 세포를 해리하여 네프론과 같은 구조를 포함하는 배아체(EB)로 조립할 수 있도록 낮은 부착 플레이트에 파종했습니다. 그러나 이러한 방법의 배치 효과는 특히 다른 iPSC에서 분명했습니다. 또한, 다른 문헌에서는 CHIR의 농도가 7 μM에서 12 μM까지 다양하다고 보고했습니다 5,13,14.
우리는 세포 밀도와 CHIR의 농도가 다양한 iPSC의 오가노이드 생성에 영향을 미칠 수 있다고 추측했으며, 이는 실험에서 여러 번 검증되었습니다. 본 프로토콜은 Kumar et al.13 의 연구 방법을 약간 수정하여 사용자에게 단계별 절차를 제공했습니다. 접근 방식의 일정과 개략도는 그림 1에 나와 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
iPSC에서 신장 오가노이드를 생성하기 위한 자세한 프로토콜이 설명되었으며, 여기에는 기저 배지, 초기 세포 밀도 및 CHIR99021 농도에 대한 약간의 변형이 포함됩니다. 다양한 실험에서 성공적인 신장 오가노이드 생성을 위한 중요한 요소는 중간 중배엽(IM)과 7일째 세포 상태의 초기 분화인 것으로 밝혀졌습니다. 더욱이, 상이한 iPSC 라인은 세포 증식 및 분화 잠재력의 변화를 나타내어 최적의 세포 …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 과거와 현재의 모든 Mao 및 Hu Lab 구성원이 흥미로운 토론과 프로젝트에 큰 기여를 한 것에 대해 매우 감사합니다. 국립아동보건임상연구센터(National Clinical Research Center for Child Health)의 큰 지원에 감사드립니다. 이 연구는 중국 국립자연과학재단(U20A20351 Jianhua Mao, 82200784 Lidan Hu), 중국 저장성 자연과학재단(No. LQ22C070004 Lidan Hu), 장쑤성 자연과학재단(보조금 번호. BK20210150 Gang Wang에게).
Materials
| 96 Well Cell Culture Plate, Flat-Bottom | NEST | Cat #701003 | |
| Accutase | STEMCELL Technologies | Cat #o7920 | |
| Antibodies | |||
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich | Cat #100-51-6 | |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | Cat #120-51-4 | |
| Biological Safety Cabinet | Haier | Cat #HR40  A2 |
|
| Biotin anti-human LTL (1:300) | Vector Laboratories | Cat #B-1325 | |
| Blood mononuclear cells hiPS-B1 (iPSc, female) | N/A | N/A | |
| Carbon dioxide level shaker | HAMANY | Cat #C0-06UC6 | |
| Chemicals, peptides, and recombinant proteins | |||
| CHIR99021 (Wnt pathway activator) | STEMCELL Technologies | Cat #72054 | |
| Costar Multiple 6 Well Cell Culture Plate | Corning | Cat #3516 | |
| Costar Ultra-Low Attachment 6 Well Plate | Corning | Cat #3471 | |
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | Cat #07930 | |
| DAPI stain Solution | Coolaber | Cat #SL7102 | |
| Dextran, Alexa Fluor 647 | Thermo SCIENTIFIC | Cat #D22914 | |
| DMEM/F-12 HEPES-free | Servicebio | Cat #G4610 | |
| Donkey Anti-Sheep IgG H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | Cat #ab150179 | |
| Donkey serum stoste | Meilunbio | Cat #MB4516-1 | |
| D-PBS (without calcium, magnesium, phenol red) | Solarbio Life Science | Cat #D1040 | |
| Dry Bath Incubator | Shanghai Jingxin | Cat #JX-10 | |
| Dylight 488-Goat Anti-Mouse IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032210 | |
| Dylight 488-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032220 | |
| Dylight 549-Goat Anti-Mouse IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032310 | |
| Dylight 549-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032320 | |
| Dylight 649-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032620 | |
| Experimental models: Cell Lines | |||
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubator | Thermo SCIENTIFIC | Cat #370 | |
| Geltre LDEV-Free | Gibco | Cat #A1413202 | |
| Glass Bottom Culture Dishes | NEST | Cat #801002 | |
| Goat anti-human CUBN (1:300) | Santa Cruz Biotechnology | Cat #sc-20607 | |
| Heparin Solution (Cell culture supplement) | STEMCELL Technologies | Cat #07980 | |
| Human Recombinant FGF-9 | STEMCELL Technologies | Cat #78161 | |
| Inverted Microscope | OLYMPUS | Cat #CKX53 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | OLYMPUS | Cat #FV3000 | |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | Cat #M7027 | |
| Micro Centrifuge | HENGNUO | Cat #2-4B | |
| Mouse anti-human CD31 (1:300) | BD Biosciences | Cat #555444 | |
| Mouse anti-human ECAD (1:300) | BD Biosciences | Cat #610182 | |
| Mouse anti-human Integrin beta 1 (1:300) | Abcam | Cat #ab30394 | |
| Mouse anti-human MEIS 1/2/3 (1:300) | Thermo SCIENTIFIC | Cat #39795 | |
| Mowiol 4-88 (Polyvinylalcohol 4-88) | Sigma-Aldrich | Cat #81381 | |
| mTeSR1 5X Supplement | STEMCELL Technologies | Cat #85852 | |
| mTeSR1 Basal Medium | STEMCELL Technologies | Cat #85851 | |
| Nunc CryoTube Vials | Thermo SCIENTIFIC | Cat #377267 | |
| Others | |||
| Rabbit anti-human GATA3 (1:300) | Cell Signaling Technology | Cat #5852S | |
| Rabbit anti-human LRP2 (1:300) | Sapphire Bioscience | Cat #NBP2-39033 | |
| Rabbit anti-human Synaptopodin (1:300) | Abcam | Cat #ab224491 | |
| Rabbit anti-human WT1 (1:300) | Abcam | Cat #ab89901 | |
| Rabbit anti-mouse PDGFR (1:300) | Abcam | Cat #ab32570 | |
| Recombinant Human Serum Albumin (rHSA) | YEASEN | Cat #20901ES03 | |
| Sheep anti-human NPHS1 (1:300) | R&D Systems | Cat #AF4269 | |
| STEMdiff APEL 2 Medium | STEMCELL Technologies | Cat #05275 | |
| Streptavidin Cy3 (1:400) | Gene Tex | Cat #GTX85902 | |
| Versene (1X) | Gibco | Cat #15040066 | |
| Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL Technologies | Cat #72304 |
Referências
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