Generering af nyreorganoider i suspension fra inducerede pluripotente stamceller
Summary
Denne protokol præsenterer en omfattende og effektiv metode til fremstilling af nyreorganoider fra inducerede pluripotente stamceller (iPSC’er) under anvendelse af suspensionskulturbetingelser. Den primære vægt i denne undersøgelse ligger i bestemmelsen af den indledende celletæthed og WNT-agonistkoncentrationen, hvilket gavner forskere, der er interesseret i nyreorganoidforskning.
Abstract
Nyreorganoider kan genereres fra inducerede pluripotente stamceller (iPSC’er) gennem forskellige tilgange. Disse organoider har et stort løfte om sygdomsmodellering, lægemiddelscreening og potentielle terapeutiske anvendelser. Denne artikel præsenterer en trinvis procedure til oprettelse af nyreorganoider fra iPSC’er, startende fra den bageste primitive stribe (PS) til den mellemliggende mesoderm (IM). Tilgangen er afhængig af APEL 2-mediet, som er et defineret, animalsk komponentfrit medium. Det suppleres med en høj koncentration af WNT-agonist (CHIR99021) i en varighed på 4 dage efterfulgt af fibroblastvækstfaktor 9 (FGF9)/heparin og en lav koncentration af CHIR99021 i yderligere 3 dage. Under denne proces lægges der vægt på at vælge den optimale celletæthed og CHIR99021 koncentration i starten af iPSC’er, da disse faktorer er kritiske for vellykket generering af nyreorganoider. Et vigtigt aspekt af denne protokol er suspensionskulturen i en plade med lav klæbeevne, hvilket gør det muligt for IM gradvist at udvikle sig til nefronstrukturer, der omfatter glomerulære, proksimale rørformede og distale rørformede strukturer, alle præsenteret i et visuelt forståeligt format. Samlet set tilbyder denne detaljerede protokol en effektiv og specifik teknik til fremstilling af nyreorganoider fra forskellige iPSC’er, hvilket sikrer vellykkede og konsistente resultater.
Introduction
Nyren spiller en kritisk rolle i opretholdelsen af fysiologisk homeostase, afhængigt af dens funktionelle enhed. Nefroner, der udskiller affaldsprodukter, kan regulere sammensætningen af kropsvæsker. Kronisk nyresygdom (CKD), forårsaget af arvelige mutationer eller andre højrisikofaktorer, vil i sidste ende udvikle sig til nyresygdom i slutstadiet (ESKD)1,2. ESKD skyldes tilsyneladende nefroners begrænsede regenereringskapacitet. Således kræves nyreerstatningsterapi. Rettet differentiering af humane iPSC’er muliggør in vitro-generering af patientspecifikke 3D-nyreorganoider, som kan bruges til at studere nyreudvikling, modellere patientspecifikke sygdomme og udføre screening af nefrotoksiske lægemidler 3,4.
Under embryonal udvikling stammer nyrerne fra den mellemliggende mesoderm (IM), som adskiller sig fra den primitive stribe (PS). Den klassiske WNT-signalvej kan fremkalde yderligere differentiering af IM med koordineret deltagelse af FGF (FGF9, FGF20) og BMP (Bmp7-signalering gennem JNK)5,6,7. De producerer to vigtige cellepopulationer af nefriske stamceller (NPC): ureteralknoppen (UB) og det metanephriske mesenchym (MM), der danner opsamlingskanalerne og nefronen, henholdsvis 8,9. Hver nephron består af glomerulære og rørformede segmenter, såsom de proksimale og distale tubuli og sløjfen af Henle10,11. Ifølge ovennævnte teori efterligner aktuelt offentliggjorte protokoller signalkaskaderne og vækstfaktorstimuleringen for at inducere nyreorganoider 5,12.
I løbet af de sidste mange år er der udviklet mange protokoller til at differentiere humane iPSC’er til nyreorganoider 5,6,7,12. Takasato et al.7 optimerede varigheden af CHIR (WNT-agonist) behandling før udskiftning med FGF9. Ifølge deres protokol er CHIR-eksponering i 4 dage efterfulgt af FGF9 i 3 dage den mest effektive måde at inducere IM fra iPSC’er på. Transwell-filtre blev brugt som kulturformat i deres procedure; Denne metode er dog vanskelig for begyndere. Derfor forsøgte Kumar et al.13 at ændre kulturformatet og valgte at suspendere kulturen. De dissocierede de klæbende celler på dag 7 til såning i lave klæbende plader for at hjælpe dem med at samle sig i embryoide kroppe (EB’er), der indeholder nefronlignende strukturer. Batcheffekten af disse metoder var imidlertid tydelig, især i forskellige iPSC’er. Derudover rapporterede forskellig litteratur, at koncentrationen af CHIR varierede fra 7 μM til 12 μM 5,13,14.
Vi spekulerede på, at koncentrationen af celletæthed og CHIR kan påvirke dannelsen af organoider i forskellige iPSC’er, og dette er blevet verificeret adskillige gange i vores eksperimenter. Den nuværende protokol har ændret undersøgelsesmetoden for Kumar et al.13 lidt og givet brugerne en trinvis procedure. Tidsplanen og skemaet for fremgangsmåden er vist i figur 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
En detaljeret protokol er blevet beskrevet for generering af nyreorganoider fra iPSC’er, der involverer mindre ændringer i basalmediet, indledende celletæthed og koncentration af CHIR99021. I forskellige eksperimenter viste det sig, at de kritiske faktorer for vellykket generering af nyreorganoider var den indledende differentiering af den mellemliggende mesoderm (IM) og celletilstanden på dag 7. Desuden udviste forskellige iPSC-linjer variationer i celleproliferation og differentieringspotentiale, hvilket resulterede…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er meget taknemmelige for alle Mao og Hu Lab-medlemmer, tidligere og nuværende, for de interessante diskussioner og store bidrag til projektet. Vi takker National Clinical Research Center for Child Health for den store støtte. Denne undersøgelse blev økonomisk støttet af National Natural Science Foundation of China (U20A20351 til Jianhua Mao, 82200784 til Lidan Hu), Natural Science Foundation of Zhejiang-provinsen i Kina (nr. LQ22C070004 til Lidan Hu) og Natural Science Foundation of Jiangsu-provinsen (tilskud nr. BK20210150 til Gang Wang).
Materials
| 96 Well Cell Culture Plate, Flat-Bottom | NEST | Cat #701003 | |
| Accutase | STEMCELL Technologies | Cat #o7920 | |
| Antibodies | |||
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich | Cat #100-51-6 | |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | Cat #120-51-4 | |
| Biological Safety Cabinet | Haier | Cat #HR40  A2 |
|
| Biotin anti-human LTL (1:300) | Vector Laboratories | Cat #B-1325 | |
| Blood mononuclear cells hiPS-B1 (iPSc, female) | N/A | N/A | |
| Carbon dioxide level shaker | HAMANY | Cat #C0-06UC6 | |
| Chemicals, peptides, and recombinant proteins | |||
| CHIR99021 (Wnt pathway activator) | STEMCELL Technologies | Cat #72054 | |
| Costar Multiple 6 Well Cell Culture Plate | Corning | Cat #3516 | |
| Costar Ultra-Low Attachment 6 Well Plate | Corning | Cat #3471 | |
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | Cat #07930 | |
| DAPI stain Solution | Coolaber | Cat #SL7102 | |
| Dextran, Alexa Fluor 647 | Thermo SCIENTIFIC | Cat #D22914 | |
| DMEM/F-12 HEPES-free | Servicebio | Cat #G4610 | |
| Donkey Anti-Sheep IgG H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | Cat #ab150179 | |
| Donkey serum stoste | Meilunbio | Cat #MB4516-1 | |
| D-PBS (without calcium, magnesium, phenol red) | Solarbio Life Science | Cat #D1040 | |
| Dry Bath Incubator | Shanghai Jingxin | Cat #JX-10 | |
| Dylight 488-Goat Anti-Mouse IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032210 | |
| Dylight 488-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032220 | |
| Dylight 549-Goat Anti-Mouse IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032310 | |
| Dylight 549-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032320 | |
| Dylight 649-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032620 | |
| Experimental models: Cell Lines | |||
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubator | Thermo SCIENTIFIC | Cat #370 | |
| Geltre LDEV-Free | Gibco | Cat #A1413202 | |
| Glass Bottom Culture Dishes | NEST | Cat #801002 | |
| Goat anti-human CUBN (1:300) | Santa Cruz Biotechnology | Cat #sc-20607 | |
| Heparin Solution (Cell culture supplement) | STEMCELL Technologies | Cat #07980 | |
| Human Recombinant FGF-9 | STEMCELL Technologies | Cat #78161 | |
| Inverted Microscope | OLYMPUS | Cat #CKX53 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | OLYMPUS | Cat #FV3000 | |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | Cat #M7027 | |
| Micro Centrifuge | HENGNUO | Cat #2-4B | |
| Mouse anti-human CD31 (1:300) | BD Biosciences | Cat #555444 | |
| Mouse anti-human ECAD (1:300) | BD Biosciences | Cat #610182 | |
| Mouse anti-human Integrin beta 1 (1:300) | Abcam | Cat #ab30394 | |
| Mouse anti-human MEIS 1/2/3 (1:300) | Thermo SCIENTIFIC | Cat #39795 | |
| Mowiol 4-88 (Polyvinylalcohol 4-88) | Sigma-Aldrich | Cat #81381 | |
| mTeSR1 5X Supplement | STEMCELL Technologies | Cat #85852 | |
| mTeSR1 Basal Medium | STEMCELL Technologies | Cat #85851 | |
| Nunc CryoTube Vials | Thermo SCIENTIFIC | Cat #377267 | |
| Others | |||
| Rabbit anti-human GATA3 (1:300) | Cell Signaling Technology | Cat #5852S | |
| Rabbit anti-human LRP2 (1:300) | Sapphire Bioscience | Cat #NBP2-39033 | |
| Rabbit anti-human Synaptopodin (1:300) | Abcam | Cat #ab224491 | |
| Rabbit anti-human WT1 (1:300) | Abcam | Cat #ab89901 | |
| Rabbit anti-mouse PDGFR (1:300) | Abcam | Cat #ab32570 | |
| Recombinant Human Serum Albumin (rHSA) | YEASEN | Cat #20901ES03 | |
| Sheep anti-human NPHS1 (1:300) | R&D Systems | Cat #AF4269 | |
| STEMdiff APEL 2 Medium | STEMCELL Technologies | Cat #05275 | |
| Streptavidin Cy3 (1:400) | Gene Tex | Cat #GTX85902 | |
| Versene (1X) | Gibco | Cat #15040066 | |
| Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL Technologies | Cat #72304 |
Referências
- Tekguc, M., et al. Kidney organoids: a pioneering model for kidney diseases. Translational Research. 250, 1-17 (2022).
- Hill, N. R., et al. Global prevalence of chronic kidney disease – a systematic review and meta-analysis. PLOS ONE. 11 (7), 0158765 (2016).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
- Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nature Cell Biology. 16 (1), 118-126 (2014).
- Morizane, R., Lam, A. Q., Freedman, B. S., Kishi, S., Valerius, M. T., Bonventre, J. V. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).
- Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nature Communications. 6 (1), 8715 (2015).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Mugford, J. W., Sipilä, P., McMahon, J. A., McMahon, A. P. Osr1 expression demarcates a multi-potent population of intermediate mesoderm that undergoes progressive restriction to an Osr1-dependent nephron progenitor compartment within the mammalian kidney. Developmental biology. 324 (1), 88-98 (2008).
- SaxOn, L., Sariola, H. Early organogenesis of the kidney. Pediatric Nephrology. 1, 385-392 (1987).
- Kobayashi, A., et al. Six2 defines and regulates a multipotent self-renewing nephron progenitor population throughout mammalian kidney development. Cell Stem Cell. 3 (2), 169-181 (2008).
- Boyle, S., et al. Fate mapping using Cited1-CreERT2 mice demonstrates that the cap mesenchyme contains self-renewing progenitor cells and gives rise exclusively to nephronic epithelia. Biologia do Desenvolvimento. 313 (1), 234-245 (2008).
- Nishinakamura, R. Human kidney organoids: progress and remaining challenges. Nature Reviews Nephrology. 15 (10), 613-624 (2019).
- Kumar, S. V., et al. Kidney micro-organoids in suspension culture as a scalable source of human pluripotent stem cell-derived kidney cells. Development. 146 (5), 172361 (2019).
- Takasato, M., Er, P. X., Chiu, H. S., Little, M. H. Generation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 11 (9), 1681-1692 (2016).
