Erzeugung von Nierenorganoiden in Suspension aus induzierten pluripotenten Stammzellen
Summary
Dieses Protokoll stellt eine umfassende und effiziente Methode zur Herstellung von Nierenorganoiden aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) unter Verwendung von Suspensionskulturbedingungen dar. Das Hauptaugenmerk dieser Studie liegt auf der Bestimmung der anfänglichen Zelldichte und der WNT-Agonistenkonzentration, was Forschern, die sich für die Erforschung von Nierenorganoiden interessieren, zugute kommt.
Abstract
Nierenorganoide können aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) durch verschiedene Ansätze erzeugt werden. Diese Organoide sind vielversprechend für die Modellierung von Krankheiten, das Screening von Medikamenten und potenzielle therapeutische Anwendungen. In diesem Artikel wird ein Schritt-für-Schritt-Verfahren zur Herstellung von Nierenorganoiden aus iPS-Zellen vorgestellt, beginnend mit dem posterioren primitiven Streifen (PS) bis zum intermediären Mesoderm (IM). Der Ansatz stützt sich auf das Medium APEL 2, bei dem es sich um ein definiertes, tierbaustofffreies Medium handelt. Es wird mit einer hohen Konzentration von WNT-Agonisten (CHIR99021) für eine Dauer von 4 Tagen ergänzt, gefolgt von Fibroblasten-Wachstumsfaktor 9 (FGF9)/Heparin und einer niedrigen Konzentration von CHIR99021 für weitere 3 Tage. Während dieses Prozesses wird der Schwerpunkt auf die Auswahl der optimalen Zelldichte und CHIR99021 Konzentration zu Beginn von iPS-Zellen gelegt, da diese Faktoren für die erfolgreiche Generierung von Nierenorganoiden entscheidend sind. Ein wichtiger Aspekt dieses Protokolls ist die Suspensionskultur in einer niedrig adhärenten Platte, die es dem IM ermöglicht, sich allmählich zu Nephronstrukturen zu entwickeln, die glomeruläre, proximale tubuläre und distale tubuläre Strukturen umfassen, die alle in einem visuell verständlichen Format präsentiert werden. Insgesamt bietet dieses detaillierte Protokoll eine effiziente und spezifische Technik zur Herstellung von Nierenorganoiden aus verschiedenen iPS-Systemen, um erfolgreiche und konsistente Ergebnisse zu gewährleisten.
Introduction
Die Niere spielt eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der physiologischen Homöostase, abhängig von ihrer funktionellen Einheit. Nephrone, die Abfallprodukte ausscheiden, können die Zusammensetzung der Körperflüssigkeiten regulieren. Eine chronische Nierenerkrankung (CKD), die durch erbliche Mutationen oder andere Hochrisikofaktoren verursacht wird, entwickelt sich schließlich zu einer Niereninsuffizienz im Endstadium (ESKD)1,2. ESKD ist offenbar auf die eingeschränkte Regenerationsfähigkeit von Nephronen zurückzuführen. Daher ist eine Nierenersatztherapie erforderlich. Die gerichtete Differenzierung humaner iPS-Zellen ermöglicht die In-vitro-Generierung patientenspezifischer 3D-Nierenorganoide, die zur Untersuchung der Nierenentwicklung, zur Modellierung patientenspezifischer Erkrankungen und zur Durchführung eines nephrotoxischen Wirkstoffscreenings verwendet werden können 3,4.
Während der Embryonalentwicklung entstehen die Nieren aus dem intermediären Mesoderm (IM), das sich vom primitiven Streifen (PS) unterscheidet. Der klassische WNT-Signalweg kann eine zusätzliche Differenzierung von IM unter koordinierter Beteiligung von FGF (FGF9, FGF20) und BMP (Bmp7-Signalweg durch JNK) induzieren5,6,7. Sie produzieren zwei wichtige Zellpopulationen von nephrischen Vorläuferzellen (NPC): die Harnleiterknospe (UB) und das metanephrische Mesenchym (MM), die die Sammelkanäle bzw. das Nephron bilden 8,9. Jedes Nephron besteht aus glomerulären und tubulären Segmenten, wie den proximalen und distalen Tubuli, und der Henle-Schleife10,11. Nach der oben genannten Theorie ahmen die derzeit veröffentlichten Protokolle die Signalkaskaden und die Stimulation des Wachstumsfaktors nach, um Nierenorganoide zu induzieren 5,12.
In den letzten Jahren wurden viele Protokolle entwickelt, um humane iPS-Zellen in Nierenorganoide zu differenzieren 5,6,7,12. Takasato et al.7 optimierten die Dauer der CHIR-Behandlung (WNT-Agonist) vor dem Ersatz durch FGF9. Gemäß ihrem Protokoll ist eine CHIR-Exposition für 4 Tage, gefolgt von FGF9 für 3 Tage, der effektivste Weg, um IM von iPS-Zellen zu induzieren. Transwell-Filter wurden als Kulturformat in ihrem Verfahren verwendet; Für Anfänger ist diese Methode jedoch schwierig. Daher versuchten Kumar et al.13, das Kulturformat zu ändern und entschieden sich, die Kultur auszusetzen. Sie dissoziierten die adhärenten Zellen an Tag 7 für die Aussaat in niedrig adhärenten Platten, um ihnen zu helfen, sich zu Embryoidkörpern (EBs) zusammenzusetzen, die nephronähnliche Strukturen enthalten. Der Batch-Effekt dieser Methoden war jedoch offensichtlich, insbesondere in verschiedenen iPS-Systemen. Darüber hinaus wurde in der Literatur berichtet, dass die Konzentration von CHIR zwischen 7 μM und 12 μM variierte 5,13,14.
Wir spekulierten, dass die Konzentration der Zelldichte und der CHIR die Bildung von Organoiden in verschiedenen iPS-Zellen beeinflussen könnte, und dies wurde in unseren Experimenten mehrfach bestätigt. Das vorliegende Protokoll hat die Studienmethode von Kumar et al.13 leicht modifiziert und den Anwendern ein Schritt-für-Schritt-Verfahren an die Hand gegeben. Der Zeitplan und das Schema des Ansatzes sind in Abbildung 1 dargestellt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es wurde ein detailliertes Protokoll für die Erzeugung von Nierenorganoiden aus iPS-Zellen beschrieben, das geringfügige Modifikationen des Basalmediums, der anfänglichen Zelldichte und der Konzentration von CHIR99021 beinhaltet. In verschiedenen Experimenten wurde festgestellt, dass die entscheidenden Faktoren für eine erfolgreiche Generierung von Nierenorganoiden die anfängliche Differenzierung des intermediären Mesoderms (IM) und der Zellzustand an Tag 7 sind. Darüber hinaus zeigten verschiedene iPSC-Linien Var…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir sind allen ehemaligen und gegenwärtigen Mitgliedern des Mao und Hu Lab sehr dankbar für die interessanten Diskussionen und die großartigen Beiträge zum Projekt. Wir danken dem National Clinical Research Center for Child Health für die großartige Unterstützung. Diese Studie wurde finanziell unterstützt von der National Natural Science Foundation of China (U20A20351 an Jianhua Mao, 82200784 an Lidan Hu), der Natural Science Foundation der chinesischen Provinz Zhejiang (No. LQ22C070004 an Lidan Hu) und der Naturwissenschaftlichen Stiftung der Provinz Jiangsu (Stipendien-Nr. BK20210150 zu Gang Wang).
Materials
| 96 Well Cell Culture Plate, Flat-Bottom | NEST | Cat #701003 | |
| Accutase | STEMCELL Technologies | Cat #o7920 | |
| Antibodies | |||
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich | Cat #100-51-6 | |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | Cat #120-51-4 | |
| Biological Safety Cabinet | Haier | Cat #HR40  A2 |
|
| Biotin anti-human LTL (1:300) | Vector Laboratories | Cat #B-1325 | |
| Blood mononuclear cells hiPS-B1 (iPSc, female) | N/A | N/A | |
| Carbon dioxide level shaker | HAMANY | Cat #C0-06UC6 | |
| Chemicals, peptides, and recombinant proteins | |||
| CHIR99021 (Wnt pathway activator) | STEMCELL Technologies | Cat #72054 | |
| Costar Multiple 6 Well Cell Culture Plate | Corning | Cat #3516 | |
| Costar Ultra-Low Attachment 6 Well Plate | Corning | Cat #3471 | |
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | Cat #07930 | |
| DAPI stain Solution | Coolaber | Cat #SL7102 | |
| Dextran, Alexa Fluor 647 | Thermo SCIENTIFIC | Cat #D22914 | |
| DMEM/F-12 HEPES-free | Servicebio | Cat #G4610 | |
| Donkey Anti-Sheep IgG H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | Cat #ab150179 | |
| Donkey serum stoste | Meilunbio | Cat #MB4516-1 | |
| D-PBS (without calcium, magnesium, phenol red) | Solarbio Life Science | Cat #D1040 | |
| Dry Bath Incubator | Shanghai Jingxin | Cat #JX-10 | |
| Dylight 488-Goat Anti-Mouse IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032210 | |
| Dylight 488-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032220 | |
| Dylight 549-Goat Anti-Mouse IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032310 | |
| Dylight 549-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032320 | |
| Dylight 649-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032620 | |
| Experimental models: Cell Lines | |||
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubator | Thermo SCIENTIFIC | Cat #370 | |
| Geltre LDEV-Free | Gibco | Cat #A1413202 | |
| Glass Bottom Culture Dishes | NEST | Cat #801002 | |
| Goat anti-human CUBN (1:300) | Santa Cruz Biotechnology | Cat #sc-20607 | |
| Heparin Solution (Cell culture supplement) | STEMCELL Technologies | Cat #07980 | |
| Human Recombinant FGF-9 | STEMCELL Technologies | Cat #78161 | |
| Inverted Microscope | OLYMPUS | Cat #CKX53 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | OLYMPUS | Cat #FV3000 | |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | Cat #M7027 | |
| Micro Centrifuge | HENGNUO | Cat #2-4B | |
| Mouse anti-human CD31 (1:300) | BD Biosciences | Cat #555444 | |
| Mouse anti-human ECAD (1:300) | BD Biosciences | Cat #610182 | |
| Mouse anti-human Integrin beta 1 (1:300) | Abcam | Cat #ab30394 | |
| Mouse anti-human MEIS 1/2/3 (1:300) | Thermo SCIENTIFIC | Cat #39795 | |
| Mowiol 4-88 (Polyvinylalcohol 4-88) | Sigma-Aldrich | Cat #81381 | |
| mTeSR1 5X Supplement | STEMCELL Technologies | Cat #85852 | |
| mTeSR1 Basal Medium | STEMCELL Technologies | Cat #85851 | |
| Nunc CryoTube Vials | Thermo SCIENTIFIC | Cat #377267 | |
| Others | |||
| Rabbit anti-human GATA3 (1:300) | Cell Signaling Technology | Cat #5852S | |
| Rabbit anti-human LRP2 (1:300) | Sapphire Bioscience | Cat #NBP2-39033 | |
| Rabbit anti-human Synaptopodin (1:300) | Abcam | Cat #ab224491 | |
| Rabbit anti-human WT1 (1:300) | Abcam | Cat #ab89901 | |
| Rabbit anti-mouse PDGFR (1:300) | Abcam | Cat #ab32570 | |
| Recombinant Human Serum Albumin (rHSA) | YEASEN | Cat #20901ES03 | |
| Sheep anti-human NPHS1 (1:300) | R&D Systems | Cat #AF4269 | |
| STEMdiff APEL 2 Medium | STEMCELL Technologies | Cat #05275 | |
| Streptavidin Cy3 (1:400) | Gene Tex | Cat #GTX85902 | |
| Versene (1X) | Gibco | Cat #15040066 | |
| Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL Technologies | Cat #72304 |
Referências
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