Получение почечных органоидов в суспензии из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток
Summary
Этот протокол представляет собой комплексный и эффективный метод получения почечных органоидов из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) с использованием условий суспензионного культивирования. Основной акцент в этом исследовании делается на определении начальной плотности клеток и концентрации агонистов WNT, что приносит пользу исследователям, заинтересованным в исследовании органоидов почек.
Abstract
Органоиды почек могут быть получены из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) с помощью различных подходов. Эти органоиды имеют большие перспективы для моделирования заболеваний, скрининга лекарств и потенциального терапевтического применения. В данной статье представлена пошаговая процедура создания почечных органоидов из ИПСК, начиная от задней примитивной полосы (ПС) до промежуточной мезодермы (ИМ). Этот подход основан на среде APEL 2, которая представляет собой определенную среду, не содержащую компонентов животного происхождения. Он дополняется высокой концентрацией агониста WNT (CHIR99021) в течение 4 дней, затем фактором роста фибробластов 9 (FGF9)/гепарином и низкой концентрацией CHIR99021 в течение дополнительных 3 дней. Во время этого процесса особое внимание уделяется выбору оптимальной плотности клеток и концентрации CHIR99021 в начале ИПСК, поскольку эти факторы имеют решающее значение для успешной генерации органоидов почек. Важным аспектом этого протокола является суспензионная культура в низкоадгезивной пластине, позволяющая ИМ постепенно развиваться в нефроновые структуры, охватывающие клубочковые, проксимальные канальцевые и дистальные канальцевые структуры, представленные в визуально понятном формате. В целом, этот подробный протокол предлагает эффективную и специфическую технику получения почечных органоидов из различных ИПСК, обеспечивая успешные и стабильные результаты.
Introduction
Почка играет важнейшую роль в поддержании физиологического гомеостаза в зависимости от ее функциональной единицы. Нефроны, которые выводят продукты жизнедеятельности, могут регулировать состав жидкостей организма. Хроническая болезнь почек (ХБП), вызванная наследственными мутациями или другими факторами высокого риска, в конечном итоге прогрессирует до терминальной стадии заболевания почек (ЭСКД)1,2. ЕСКД, по-видимому, обусловлен ограниченной способностью нефронов к регенерации. Таким образом, требуется заместительная почечная терапия. Направленная дифференцировка ИПСК человека позволяет генерировать in vitro специфические для пациента 3D-органоиды почек, которые могут быть использованы для изучения развития почек, моделирования специфических для пациента заболеваний и проведения скрининга нефротоксических препаратов 3,4.
Во время эмбрионального развития почки берут начало из промежуточной мезодермы (ИМ), которая дифференцируется от примитивной полосы (ПВ). Классический сигнальный путь WNT может индуцировать дополнительную дифференцировку ИМ при скоординированном участии FGF (FGF9, FGF20) и BMP (Bmp7 через JNK)5,6,7. Они продуцируют две важные клеточные популяции нефрических клеток-предшественников (NPC): почки мочеточника (UB) и метанефрическую мезенхиму (MM), образуя собирательные протоки и нефрон, соответственно 8,9. Каждый нефрон состоит из клубочковых и трубчатых сегментов, таких как проксимальные и дистальные канальцы, а также петли Генле10,11. Согласно вышеупомянутой теории, опубликованные в настоящее время протоколы имитируют сигнальные каскады и стимуляцию факторов роста для индуцирования почечных органоидов 5,12.
За последние несколько лет было разработано множество протоколов для дифференциации ИПСК человека в почечные органоиды 5,6,7,12. Takasato et al.7 оптимизировали продолжительность лечения CHIR (агонистом WNT) перед заменой на FGF9. Согласно их протоколу, воздействие CHIR в течение 4 дней с последующим введением FGF9 в течение 3 дней является наиболее эффективным способом индуцирования внутримышечного введения из ИПСК. В качестве культурального формата в их процедуре использовались фильтры Transwell; Однако этот способ сложен для новичков. Поэтому Kumar et al.13 попытались изменить формат культуры и решили приостановить ее действие. Они диссоциировали адгезивные клетки на 7-й день для посева в низкие адгезивные пластины, чтобы помочь им собраться в эмбриоидные тела (ЭБ), которые содержат нефроноподобные структуры. Тем не менее, пакетный эффект этих методов был очевиден, особенно в различных ИПСК. Кроме того, в различных литературных источниках сообщалось, что концентрация CHIR варьировала от 7 мкМ до 12 мкМ 5,13,14.
Мы предположили, что концентрация клеточной плотности и CHIR могут влиять на генерацию органоидов в различных ИПСК, и это было проверено много раз в наших экспериментах. Настоящий протокол несколько модифицировал метод исследования Kumar et al.13 и предоставил пользователям пошаговую процедуру. График и схема подхода представлены на рисунке 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Был описан подробный протокол получения почечных органоидов из ИПСК, включающий незначительные модификации базальной среды, исходной плотности клеток и концентрации CHIR99021. В различных экспериментах было установлено, что критическими факторами для успешной генерации почечных органо?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы чрезвычайно благодарны всем членам Лаборатории Мао и Ху, бывшим и нынешним, за интересные дискуссии и большой вклад в проект. Благодарим Национальный клинический исследовательский центр детского здоровья за большую поддержку. Это исследование было проведено при финансовой поддержке Национального фонда естественных наук Китая (U20A20351 Цзяньхуа Мао, 82200784 Лидань Ху), Фонда естественных наук провинции Чжэцзян Китая (No. LQ22C070004 Лидань Ху) и Фонд естественных наук провинции Цзянсу (гранты No 1). BK20210150 Ган Вану).
Materials
| 96 Well Cell Culture Plate, Flat-Bottom | NEST | Cat #701003 | |
| Accutase | STEMCELL Technologies | Cat #o7920 | |
| Antibodies | |||
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich | Cat #100-51-6 | |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | Cat #120-51-4 | |
| Biological Safety Cabinet | Haier | Cat #HR40  A2 |
|
| Biotin anti-human LTL (1:300) | Vector Laboratories | Cat #B-1325 | |
| Blood mononuclear cells hiPS-B1 (iPSc, female) | N/A | N/A | |
| Carbon dioxide level shaker | HAMANY | Cat #C0-06UC6 | |
| Chemicals, peptides, and recombinant proteins | |||
| CHIR99021 (Wnt pathway activator) | STEMCELL Technologies | Cat #72054 | |
| Costar Multiple 6 Well Cell Culture Plate | Corning | Cat #3516 | |
| Costar Ultra-Low Attachment 6 Well Plate | Corning | Cat #3471 | |
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | Cat #07930 | |
| DAPI stain Solution | Coolaber | Cat #SL7102 | |
| Dextran, Alexa Fluor 647 | Thermo SCIENTIFIC | Cat #D22914 | |
| DMEM/F-12 HEPES-free | Servicebio | Cat #G4610 | |
| Donkey Anti-Sheep IgG H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | Cat #ab150179 | |
| Donkey serum stoste | Meilunbio | Cat #MB4516-1 | |
| D-PBS (without calcium, magnesium, phenol red) | Solarbio Life Science | Cat #D1040 | |
| Dry Bath Incubator | Shanghai Jingxin | Cat #JX-10 | |
| Dylight 488-Goat Anti-Mouse IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032210 | |
| Dylight 488-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032220 | |
| Dylight 549-Goat Anti-Mouse IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032310 | |
| Dylight 549-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032320 | |
| Dylight 649-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032620 | |
| Experimental models: Cell Lines | |||
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubator | Thermo SCIENTIFIC | Cat #370 | |
| Geltre LDEV-Free | Gibco | Cat #A1413202 | |
| Glass Bottom Culture Dishes | NEST | Cat #801002 | |
| Goat anti-human CUBN (1:300) | Santa Cruz Biotechnology | Cat #sc-20607 | |
| Heparin Solution (Cell culture supplement) | STEMCELL Technologies | Cat #07980 | |
| Human Recombinant FGF-9 | STEMCELL Technologies | Cat #78161 | |
| Inverted Microscope | OLYMPUS | Cat #CKX53 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | OLYMPUS | Cat #FV3000 | |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | Cat #M7027 | |
| Micro Centrifuge | HENGNUO | Cat #2-4B | |
| Mouse anti-human CD31 (1:300) | BD Biosciences | Cat #555444 | |
| Mouse anti-human ECAD (1:300) | BD Biosciences | Cat #610182 | |
| Mouse anti-human Integrin beta 1 (1:300) | Abcam | Cat #ab30394 | |
| Mouse anti-human MEIS 1/2/3 (1:300) | Thermo SCIENTIFIC | Cat #39795 | |
| Mowiol 4-88 (Polyvinylalcohol 4-88) | Sigma-Aldrich | Cat #81381 | |
| mTeSR1 5X Supplement | STEMCELL Technologies | Cat #85852 | |
| mTeSR1 Basal Medium | STEMCELL Technologies | Cat #85851 | |
| Nunc CryoTube Vials | Thermo SCIENTIFIC | Cat #377267 | |
| Others | |||
| Rabbit anti-human GATA3 (1:300) | Cell Signaling Technology | Cat #5852S | |
| Rabbit anti-human LRP2 (1:300) | Sapphire Bioscience | Cat #NBP2-39033 | |
| Rabbit anti-human Synaptopodin (1:300) | Abcam | Cat #ab224491 | |
| Rabbit anti-human WT1 (1:300) | Abcam | Cat #ab89901 | |
| Rabbit anti-mouse PDGFR (1:300) | Abcam | Cat #ab32570 | |
| Recombinant Human Serum Albumin (rHSA) | YEASEN | Cat #20901ES03 | |
| Sheep anti-human NPHS1 (1:300) | R&D Systems | Cat #AF4269 | |
| STEMdiff APEL 2 Medium | STEMCELL Technologies | Cat #05275 | |
| Streptavidin Cy3 (1:400) | Gene Tex | Cat #GTX85902 | |
| Versene (1X) | Gibco | Cat #15040066 | |
| Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL Technologies | Cat #72304 |
Referências
- Tekguc, M., et al. Kidney organoids: a pioneering model for kidney diseases. Translational Research. 250, 1-17 (2022).
- Hill, N. R., et al. Global prevalence of chronic kidney disease – a systematic review and meta-analysis. PLOS ONE. 11 (7), 0158765 (2016).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
- Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nature Cell Biology. 16 (1), 118-126 (2014).
- Morizane, R., Lam, A. Q., Freedman, B. S., Kishi, S., Valerius, M. T., Bonventre, J. V. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).
- Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nature Communications. 6 (1), 8715 (2015).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Mugford, J. W., Sipilä, P., McMahon, J. A., McMahon, A. P. Osr1 expression demarcates a multi-potent population of intermediate mesoderm that undergoes progressive restriction to an Osr1-dependent nephron progenitor compartment within the mammalian kidney. Developmental biology. 324 (1), 88-98 (2008).
- SaxOn, L., Sariola, H. Early organogenesis of the kidney. Pediatric Nephrology. 1, 385-392 (1987).
- Kobayashi, A., et al. Six2 defines and regulates a multipotent self-renewing nephron progenitor population throughout mammalian kidney development. Cell Stem Cell. 3 (2), 169-181 (2008).
- Boyle, S., et al. Fate mapping using Cited1-CreERT2 mice demonstrates that the cap mesenchyme contains self-renewing progenitor cells and gives rise exclusively to nephronic epithelia. Biologia do Desenvolvimento. 313 (1), 234-245 (2008).
- Nishinakamura, R. Human kidney organoids: progress and remaining challenges. Nature Reviews Nephrology. 15 (10), 613-624 (2019).
- Kumar, S. V., et al. Kidney micro-organoids in suspension culture as a scalable source of human pluripotent stem cell-derived kidney cells. Development. 146 (5), 172361 (2019).
- Takasato, M., Er, P. X., Chiu, H. S., Little, M. H. Generation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 11 (9), 1681-1692 (2016).
