We hebben een methodologie ontwikkeld om te beoordelen of neoplasmata van het zenuwstelsel in genetisch gemanipuleerde muizen de pathologie van hun menselijke tegenhangers nauwkeurig samenvatten. Hier passen we deze histologische technieken, gedefinieerde pathologische criteria en kweekmethodologieën toe op neurofibromen en kwaadaardige perifere zenuwschedetumoren die ontstaan in het P 0-GGFβ3 muismodel.
Patiënten met het autosomaal dominante tumorgevoeligheidssyndroom neurofibromatose type 1 (NF1) ontwikkelen vaak plexiforme neurofibromen (PN’s) die vervolgens transformeren in zeer agressieve kwaadaardige perifere zenuwschedetumoren (MPNST’s). Het begrijpen van het proces waarmee een PN transformeert in een MPNST zou worden vergemakkelijkt door de beschikbaarheid van genetisch gemanipuleerde muismodellen (GEM) die de PN-MPNST-progressie die bij mensen met NF1 wordt gezien, nauwkeurig repliceren. Helaas geven GEM-modellen met Nf1-ablatie dit proces niet volledig weer. Dit bracht ons ertoe om P 0-GGFβ3-muizen te ontwikkelen, een GEM-model waarin overexpressie van het Schwann-celmitogeen neureguline-1 (NRG1) in Schwann-cellen resulteert in de ontwikkeling van PN’s die zich ontwikkelen tot MPNST’s met hoge frequentie. Om echter te bepalen of tumorigenese en neoplastische progressie bij P 0-GGFβ3-muizen de processen die worden gezien bij NF1-patiënten nauwkeurig modelleren, moesten we eerst bewijzen dat de pathologie van P0-GGFβ3-tumoren in de perifere zenuwschede de pathologie van hun menselijke tegenhangers recapituleert.
Hier beschrijven we de gespecialiseerde methodologieën die worden gebruikt om neoplasmata van het perifere zenuwstelsel nauwkeurig te diagnosticeren en te beoordelen in GEM-modellen, met behulp van P 0-GGFβ3 en P0-GGFβ3; Trp53+/- muizen als voorbeeld. We beschrijven de histologische, immunohistochemische en histochemische methoden die worden gebruikt om PN’s en MPNST’s te diagnosticeren, hoe deze neoplasmata te onderscheiden van andere tumortypes die hun pathologie nabootsen, en hoe deze neoplasmata te beoordelen. We bespreken de oprichting van vroege passageculturen van GEM MPNST’s, hoe deze culturen kunnen worden gekarakteriseerd met behulp van immunocytochemie en hoe hun tumorigeniciteit kan worden geverifieerd door allotransplantaten vast te stellen. Gezamenlijk karakteriseren deze technieken de pathologie van PN’s en MPNST’s die zich voordoen in GEM-modellen en vergelijken ze kritisch de pathologie van deze muizentumoren met hun menselijke tegenhangers.
In de afgelopen drie decennia hebben talloze laboratoria geprobeerd muismodellen van menselijke kankers te maken door menselijke kanker-geassocieerde mutaties in het muizengenoom te introduceren of door een genproduct tot overexpressie te brengen dat tot overexpressie wordt gebracht in menselijke kankers. De resulterende genetisch gemanipuleerde muismodellen (GEM) kunnen voor verschillende doeleinden worden gebruikt, zoals het vaststellen dat de nieuw geïntroduceerde genomische modificatie tumorigenese initieert, het identificeren van andere later optredende genetische of epigenetische veranderingen die bijdragen aan tumorprogressie, en het definiëren van de belangrijkste signaalroutes die tumorinitiatie en -progressie stimuleren. In tegenstelling tot orthotope xenotransplantaatmodellen, die afhankelijk zijn van het gebruik van immunodeficiënte muizen, hebben GEM-kankermodellen een volledig functioneel immuunsysteem en modelleren ze dus nauwkeuriger reacties op kandidaat-therapeutische middelen. Bij het gebruik van GEM-kankermodellen voor doeleinden als deze, is het echter essentieel dat onderzoekers bevestigen dat waarnemingen met GEM-neoplasmata relevant zijn voor hun menselijke tegenhangers. Deze validatie moet een grondige beoordeling van de pathologie van de GEM-neoplasmata omvatten en een bepaling of de pathologische kenmerken van de GEM-neoplasmata de pathologie van het overeenkomstige menselijke tumortype recapituleren.
Het tumorgevoeligheidssyndroom neurofibromatose type 1 (NF1) is de meest voorkomende genetische ziekte die het menselijk zenuwstelsel aantast en voorkomt bij ongeveer 1 op de 3.000-3.500 levendgeborenen 1,2,3. Personen die lijden aan NF1 ontwikkelen meerdere goedaardige perifere zenuwschedetumoren die bekend staan als neurofibromen in hun huid (dermale neurofibromen) en in grote zenuwen en zenuwplexussen (plexiforme neurofibromen). Hoewel zowel dermale als plexiforme neurofibromen de kwaliteit van leven van de patiënt verslechteren door fysieke, gedrags- en/of sociale beperkingen te veroorzaken, zijn plexiforme neurofibromen (PN’s) bijzonder gevaarlijk 4,5. Dit komt omdat PN’s vaak veranderen in kwaadaardige perifere zenuwschedetumoren (MPNST’s), dit zijn agressieve spindelcelneoplasmata met een uitzonderlijk laag overlevingspercentage 1,2. Voor een groot deel is dit lage overlevingspercentage te wijten aan het feit dat de radio- en chemotherapeutische regimes die momenteel worden gebruikt om MPNST’s te behandelen, niet effectief zijn. Het ontwikkelen van nieuwe, effectievere therapieën was echter een uitdaging. Dit komt omdat, ondanks hoe vaak MPNST’s voorkomen bij NF1-patiënten, het nog steeds zeldzame neoplasmata zijn. Als gevolg hiervan is het erg moeilijk om grote aantallen menselijke tumoren voor onderzoek te verkrijgen; het is ook een uitdaging om voldoende patiënten met MPNST’s te rekruteren voor klinische onderzoeken. Om deze beperkingen te overwinnen, zijn verschillende GEM-modellen gegenereerd met als doel meer inzicht te krijgen in de afwijkingen die de pathogenese van neurofibroom en de progressie van PN-MPNST aansturen en om preklinische proeven met kandidaat-therapeutische middelen te vergemakkelijken.
NF1-patiënten hebben inactiverende mutaties in één kopie van het NF1-gen. De pathogenese van neurofibroom wordt geactiveerd wanneer een inactiverende mutatie in het resterende functionele NF1-gen optreedt in een cel in de Schwann-cellijn. Verrassend genoeg echter, toen muizen werden gegenereerd met kiembaaninactiverende Nf1-mutaties, ontwikkelden ze geen neurofibromen 6,7. De daaropvolgende demonstratie dat muizen met Nf1-null Schwann-cellen en Nf1 haplo-insufficiëntie in alle andere celtypen (Krox20-Cre;Nf1flox/- muizen) ontwikkelde plexiforme neurofibromen suggereerden dat een verlaagde dosering van het Nf1-gen in extra celtypen vereist was voor de pathogenese van neurofibroom8. Zelfs dan, de plexiforme neurofibromen in Krox20-Cre; Nf1flox/- muizen ontwikkelden zich niet tot MPNST’s en bootsten dus slechts gedeeltelijk de biologie van hun menselijke tegenhangers na. MPNST-pathogenese trad op wanneer Nf1-mutaties gepaard gingen met mutaties in aanvullende tumorsuppressorgenen zoals Trp539 of Cdkn2a10, maar MPNST’s in deze GEM-modellen ontwikkelden zich de novo of uit atypische neurofibromateuze neoplasmata van onzeker biologisch potentieel (ANNUBP’s)11,12, in plaats van uit reeds bestaande goedaardige plexiforme neurofibromen (zie13,14 voor uitstekende beoordelingen van deze modellen en andere modellen die aanvullende MPNST-geassocieerde mutaties met functieverlies introduceren in genen zoals Suz12 pt Pten15).
Deze muismodellen zijn van onschatbare waarde geweest voor het vaststellen van de rol die genen zoals NF1, TP53 pt CDKN2A spelen in de pathogenese van NF1-geassocieerde neoplasmata van het perifere zenuwstelsel en voor preklinische onderzoeken die kandidaat-therapeutische middelen testen. We hebben echter nog steeds een onvolledig begrip van het proces waardoor plexiforme neurofibromen zich ontwikkelen tot atypische neurofibromateuze neoplasmata met een onzeker biologisch potentieel (ANNUBP’s16) en vervolgens MPNST’s. Er is onlangs enige vooruitgang geboekt in het begrijpen van dit proces met het recente rapport dat muizen met deleties in Nf1 pt Arf ANNUBP’s ontwikkelen die evolueren naar MPNST’s11. Er bestaan echter nog geen op Nf1-mutatie gebaseerde muismodellen die het proces van plexiforme neurofibroom-MPNST-progressie bij mensen volledig samenvatten. Bovendien is het niet duidelijk of er meerdere verschillende routes zijn die leiden tot de ontwikkeling van MPNST’s. Daarom is het mogelijk dat de hierboven beschreven GEM’s slechts een subset van verschillende routes modelleren die leiden tot neurofibroom-MPNST-progressie en MPNST-pathogenese. Dit punt wordt benadrukt door het feit dat MPNST’s ook sporadisch voorkomen en dat sommige sporadische MPNST’s blijkbaar geen NF1-mutaties hebben17,18.
Hoewel dit laatste punt is aangevochten door de recente suggestie van Magollon-Lorenz et al. dat ten minste enkele sporadische MPNST’s zonder NF1-mutaties melanomen of een ander type sarcoomzijn 19, hebben we onlangs een sporadische MPNST en een cellijn afgeleid van deze tumor (2XSB-cellen) gerapporteerd die NF1 wildtype20 was. Tijdens de karakterisering van de moedertumor en de 2XSB-cellijn hebben we systematisch alternatieve diagnostische mogelijkheden uitgesloten, waaronder melanoom en de vele andere sarcoomtypes die routinematig worden overwogen in de differentiële diagnose van een sporadische kwaadaardige perifere zenuwschedetumor20. Bovendien merken we op dat Magollon-Lorenz et al. erkenden dat hun bevindingen in de drie sporadische MPNST-cellijnen die ze bestudeerden niet konden worden gegeneraliseerd om aan te geven dat alle tumoren die als sporadische MPNST’s worden geïdentificeerd, geen MPNST’s zijn.
Om een GEM-model te construeren waarin neurofibroom en MPNST-pathogenese niet noodzakelijkerwijs afhankelijk waren van specifieke tumorsuppressorgenmutaties, genereerden we transgene muizen waarin overexpressie van het krachtige Schwann-celmitogeen neureguline-1 (NRG1) werd aangedreven door de Schwann-celspecifieke myeline-eiwit nul (P0) promotor (P 0-GGFβ3-muizen)21. We hebben eerder aangetoond dat menselijke neurofibromen, MPNST’s en MPNST-cellijnen verschillende NRG1-isovormen tot expressie brengen, samen met de erbB-receptortyrosinekinasen (erbB2, erbB3 en erbB4) die NRG1-signalering mediëren en dat deze erbB-receptoren constitutief worden geactiveerd22. We hebben ook aangetoond dat farmacologische remmers van de erbB-kinasen de proliferatie van MPNST22, overleving23 en migratie24 krachtig remmen. In overeenstemming met onze waarnemingen bij mensen, ontwikkelen P 0-GGFβ3-muizen plexiforme neurofibromen25 die zich ontwikkelen tot MPNST’s met een hoge frequentie21,25. We hebben aangetoond dat P 0-GGFβ3 MPNST’s, net als hun menselijke tegenhangers, vaak mutaties van Trp53 pt Cdkn2a ontwikkelen, evenals tal van andere genomische afwijkingen die mogelijk bijdragen aan tumorigenese25. MPNST’s die voorkomen in P 0-GGFβ3-muizen hebben geen inactiverende Nf1-mutaties. Met behulp van genetische complementatie toonden we echter aan dat NRG1 tumorigenese bevordert bij P 0-GGFβ3-muizen, voornamelijk via dezelfde signaalcascades die worden veranderd door Nf1-verlies 26; deze conclusie is gebaseerd op onze bevinding dat het vervangen van NRG1-overexpressie door Nf1-verlies in aanwezigheid van Trp53-haplo-insufficiëntie (P 0-GGFβ3;Trp53+/- muizen) produceert dieren waarin MPNST’s zich de novo ontwikkelen, zoals te zien is in cis-Nf1+/-; Trp53+/- muizen27.
Om deze en andere informatie te verkrijgen die aantoont dat P 0-GGFβ3-muizen nauwkeurig de processen van pathogenese van neurofibroom en progressie van neurofibroom-MPNST modelleren die worden gezien bij mensen met NF1, hebben we gespecialiseerde methodologieën ontwikkeld voor het verwerken van weefsels van deze dieren, het nauwkeurig diagnosticeren van hun tumoren, het beoordelen van de MPNST’s die bij deze muizen ontstaan, het vaststellen en karakteriseren van vroege passage P0-GGFβ3 en P0-GGFβ3; Trp53+/- MPNST-culturen en kritische vergelijking van de pathologie van P 0-GGFβ3 PN’s en MPNST’s en P0-GGFβ3; Trp53+/- MPNST’s aan die van hun menselijke tegenhangers. Veel van deze methodologieën zijn generaliseerbaar naar andere GEM-modellen van neoplasie van het zenuwstelsel. Bovendien zijn verschillende van deze methodologieën breder toepasbaar op GEM-modellen waarin neoplasmata ontstaan in andere orgaansites. Daarom geven we hier een gedetailleerde beschrijving van deze methodologieën.
De histologische en biochemische methoden die hier worden gepresenteerd, bieden een kader voor het diagnosticeren en karakteriseren van GEM-modellen van neurofibroom en MPNST-pathogenese. In de loop der jaren hebben we ontdekt dat deze methodologieën zeer nuttig zijn voor het beoordelen van de pathologie van perifere zenuwschedetumoren die zich voordoen in GEM-modellen 21,25,26. Hoewel de hier geschetste protocollen nuttig zijn…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door subsidies van het National Institute of Neurological Diseases and Stroke (R01 NS048353 en R01 NS109655 aan S.L.C.; R01 NS109655-03S1 aan D.P.J.), het National Cancer Institute (R01 CA122804 aan S.L.C.) en het Ministerie van Defensie (X81XWH-09-1-0086 en W81XWH-12-1-0164 aan S.L.C.).
100 mm Tissue Culture Plates | Corning Falcon | 353003 | |
3, 3'- Diaminobensidine (DAB) | Vector Laboratories | SK-400 | |
6- well plates | Corning Costar | 3516 | |
Acetic Acid | Fisher Scientific | A38-212 | |
Alexa Fluor 488 Secondary (Goat Anti-Mouse) | Invitrogen | A11029 | |
Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Mouse) | Invitrogen | A21043 or A11004 | |
Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Rabbit) | Invitrogen | A11036 | |
Ammonium Chloride (NH4Cl) | Fisher Scientific | A661-500 | |
BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
Caldesmon | ABCAM | E89, ab32330 | |
CD117 | Cell Marque | 117R-18-ASR | |
CD163 | Leica | NCL-L-CD163 | |
CD31 | ABCAM | ab29364 | |
CD34 | ABCAM | ab81289 | |
CD86 | ABCAM | ab53004 | |
Cell Scraper | Sarstedt | 83.183 | |
Cell Stripper | Corning | 25-056-CI | |
Circle Coverslip | Fisher Scientific | 12-545-100 | |
Citrisolve Hybrid (d-limonene-based solvent) | Decon Laboratories | 5989-27-5 | |
Critic Acid | Fisher Scientific | A104-500 | |
Cytokeratin | ABCAM | C-11, ab7753 | |
Desmin | Agilent Dako | clone D33 (M0760) | |
Diaminobensizdine (DAB) Solution | Vector Laboratories | SK-4100 | |
DMEM | Corning | 15-013-CV | |
Eosin Y | Thermo Scientific | 7111 | |
Ethanol (200 Proof) | Decon Laboratories | 2716 | |
Fetal Calf Serum | Omega Scientific | FB-01 | |
Forksolin | Sigma-Aldrich | F6886 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G6279 | |
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | 21-022-CV | |
Harris Hematoxylin | Fisherbrand | 245-677 | |
Hemacytometer | Brightline-Hauser Scientific | 1490 | |
Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-212 | |
Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | 327-500 | |
Iba1 | Wako Chemicals | 019-19741 | |
ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit ,Mouse on Mouse | Vector Laboratories | MP-2400 | |
ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit, Horse Anti-Rabbit | Vector Laboratories | MP-7401 | |
Incubator | Thermo Scientific | Heracell 240i CO2 incubator | |
Isoflurane | Piramal | NDC 66794-017-25 | |
Isopropanol | Fisher Scientific | A415 | |
Ki-67 | Cell Signaling | 12202 | |
Laminin | Thermo Fisher Scientific | 23017015 | |
Liquid Nitrogen | |||
MART1 | ABCAM | M2-9E3, ab187369 | |
Microtome | |||
Nestin | Millipore | Human: MAD5236 (10C2), Human:MAB353 (Rat-401) | |
Neuregulin 1 beta | In house | Made by S.L.C. (also available as 396-HB-050/CF from R&D Systems) | |
Neurofibromin | Santa Cruz Biotechnology | sc-67 | |
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ mice | Jackson Laboratory | 5557 | |
Nonfat Dry Milk | Walmart | Great Value Brand | |
P0-GGFβ3 mice | In house | ||
Paraffin Wax | Leica | Paraplast 39601006 | |
Parafilm M | Sigma-Aldrich | PM-999 | |
Paraformaldehyde (4%) | Thermo Scientific | J19943-K2 | |
Permount (Xylene Mounting Medium) | Fisher Scientific | SP15-100 | |
pH Meter | Mettler Toldedo | Seven Excellence, 8603 | |
Phosphate Buffered Saline (Dulbecco's) | Corning | 20-031-CV | |
PMEL | ABCAM | EP4863(2), ab137078 | |
Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P5899-5MG | |
Portable Isoflurance Machine | VetEquip Inhalation Anesthesia Systems | ||
PVA-DABCO (Aqueous Mounting Medium) | Millipore Sigma | 10981100ML | |
Rice Cooker | Beech Hamilton | ||
S100B | Agilent Dako | Z0311 (now GA504) | |
SMA | Ventana Medical Systems | clone 1A4 | |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | S640 | |
Sodium Citrate (Dihydrate) | Fisher Scientific | BP327-1 | |
Sox10 | ABCAM | ab212843 | |
Steel histology mold | |||
Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
TCF4/TCFL2 | Cell Signaling | (CH48H11) #2569 | |
Tissue Cassette | |||
Toluidine Blue | ACROS Organics | 348600050 | |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
TRIzol | Invitrogen | 15596026 | |
Trypsin | Corning | 25-051-31 |