Identifizierung, Diagnose und Einstufung bösartiger peripherer Nervenscheidentumoren in gentechnisch veränderten Mausmodellen

Summary

Wir haben eine Methodik entwickelt, um zu beurteilen, ob Neubildungen des Nervensystems in gentechnisch veränderten Mäusen die Pathologie ihrer menschlichen Gegenstücke genau rekapitulieren. Hier wenden wir diese histologischen Techniken, definierten pathologischen Kriterien und Kulturmethoden auf Neurofibrome und maligne periphere Nervenscheidentumoren an, die im P 0-GGFβ3-Mausmodell auftreten.

Abstract

Patienten mit dem autosomal-dominanten Tumoranfälligkeitssyndrom Neurofibromatose Typ 1 (NF1) entwickeln häufig plexiforme Neurofibrome (PNs), die sich anschließend in hochaggressive maligne periphere Nervenscheidentumoren (MPNSTs) verwandeln. Das Verständnis des Prozesses, durch den sich ein PN in ein MPNST verwandelt, würde durch die Verfügbarkeit von gentechnisch veränderten Mausmodellen (GEM) erleichtert, die das PN-MPNST-Fortschreiten beim Menschen mit NF1 genau replizieren. Leider rekapitulieren GEM-Modelle mit Nf1-Ablation diesen Prozess nicht vollständig. Dies führte uns zur Entwicklung von P 0-GGFβ3-Mäusen, einem GEM-Modell, in dem die Überexpression des Schwann-Zell-Mitogens Neuregulin-1 (NRG1) in Schwann-Zellen zur Entwicklung von PNs führt, die sich mit hoher Frequenz zu MPNSTs entwickeln. Um jedoch festzustellen, ob die Tumorgenese und die neoplastische Progression in P 0-GGFβ3-Mäusen die bei NF1-Patienten beobachteten Prozesse genau modellieren, mussten wir zunächst nachweisen, dass die Pathologie von P_{0-GGFβ3-Tumoren} der peripheren Nervenscheide die Pathologie ihrer menschlichen Gegenstücke rekapituliert.

Hier beschreiben wir die spezialisierten Methoden, die zur genauen Diagnose und Bewertung von Neoplasien des peripheren Nervensystems in GEM-Modellen verwendet werden, wobei P 0-GGFβ3 und P_0-GGFβ3 verwendet werden; Trp53^+/- Mäuse als Beispiel. Wir beschreiben die histologischen, immunhistochemischen und histochemischen Methoden, die zur Diagnose von PNs und MPNSTs verwendet werden, wie man diese Neoplasien von anderen Tumorarten unterscheidet, die ihre Pathologie nachahmen, und wie man diese Neoplasien einstuft. Wir diskutieren die Etablierung von Frühpassagekulturen aus GEM-MPNSTs, wie diese Kulturen mit Hilfe der Immunzytochemie charakterisiert werden können und wie ihre Tumorigenität durch die Etablierung von Allotransplantaten verifiziert werden kann. Zusammengenommen charakterisieren diese Techniken die Pathologie von PNs und MPNSTs, die in GEM-Modellen auftreten, und vergleichen die Pathologie dieser murinen Tumoren kritisch mit ihren menschlichen Gegenstücken.

Introduction

In den letzten drei Jahrzehnten haben zahlreiche Laboratorien versucht, Mausmodelle für menschliche Krebserkrankungen zu erstellen, indem sie menschliche krebsassoziierte Mutationen in das Mausgenom einführten oder ein Genprodukt überexprimierten, das bei menschlichen Krebsarten überexprimiert wird. Die resultierenden gentechnisch veränderten Mausmodelle (GEM) können für eine Vielzahl von Zwecken verwendet werden, z. B. um festzustellen, dass die neu eingeführte genomische Modifikation die Tumorentstehung einleitet, um andere später auftretende genetische oder epigenetische Veränderungen zu identifizieren, die zur Tumorprogression beitragen, und um die wichtigsten Signalwege zu definieren, die die Tumorinitiierung und -progression vorantreiben. Im Gegensatz zu orthotopen Xenotransplantatmodellen, die auf der Verwendung von immundefizienten Mäusen beruhen, verfügen GEM-Krebsmodelle über ein voll funktionsfähiges Immunsystem und modellieren daher das Ansprechen auf Therapeutikakandidaten genauer. Bei der Verwendung von GEM-Krebsmodellen für solche Zwecke ist es jedoch wichtig, dass die Forscher bestätigen, dass Beobachtungen mit GEM-Neoplasien für ihre menschlichen Kollegen relevant sind. Diese Validierung sollte eine gründliche Beurteilung der Pathologie der GEM-Neoplasien und eine Feststellung umfassen, ob die pathologischen Merkmale der GEM-Neoplasien die Pathologie des entsprechenden menschlichen Tumortyps rekapitulieren.

Das Tumoranfälligkeitssyndrom Neurofibromatose Typ 1 (NF1) ist die häufigste genetische Erkrankung des menschlichen Nervensystems und tritt bei etwa 1 von 3.000-3.500 Lebendgeburten auf ^1,2,3. Personen, die von NF1 betroffen sind, entwickeln mehrere gutartige periphere Nervenscheidentumoren, die als Neurofibrome bekannt sind, in ihrer Haut (dermale Neurofibrome) und in großen Nerven und Nervengeflechten (plexiforme Neurofibrome). Während sowohl dermale als auch plexiforme Neurofibrome die Lebensqualität des Patienten verschlechtern, indem sie körperliche, verhaltensbezogene und/oder soziale Beeinträchtigungen hervorrufen, sind plexiforme Neurofibrome (PNs) besonders gefährlich ^4,5. Dies liegt daran, dass sich PNs häufig in bösartige periphere Nervenscheidentumoren (MPNSTs) verwandeln, bei denen es sich um aggressive Spindelzellneoplasien mit einer außergewöhnlich niedrigen Überlebensrate handelt ^1,2. Diese niedrige Überlebensrate ist zum großen Teil darauf zurückzuführen, dass die derzeit zur Behandlung von MPNSTs verwendeten Radio- und Chemotherapien unwirksam sind. Die Entwicklung neuer, wirksamerer Therapien war jedoch eine Herausforderung. Dies liegt daran, dass MPNSTs trotz der Häufigkeit des Auftretens bei NF1-Patienten immer noch seltene Neoplasien sind. Infolgedessen ist es sehr schwierig, eine große Anzahl menschlicher Tumore für Studien zu erhalten. es ist auch schwierig, genügend Patienten mit MPNSTs für klinische Studien zu rekrutieren. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurden mehrere GEM-Modelle erstellt, mit dem Ziel, weitere Einblicke in die Anomalien zu gewinnen, die die Pathogenese des Neurofibroms und die PN-MPNST-Progression vorantreiben, und präklinische Studien mit Therapeutikakandidaten zu erleichtern.

NF1-Patienten haben inaktivierende Mutationen in einer Kopie des NF1-Gens. Die Neurofibrom-Pathogenese wird ausgelöst, wenn eine inaktivierende Mutation im verbleibenden funktionellen NF1-Gen in einer Zelle der Schwann-Zelllinie auftritt. Überraschenderweise entwickelten Mäuse, die mit keimbahninaktivierenden Nf1-Mutationen erzeugt wurden, keine Neurofibrome ^6,7. Der anschließende Nachweis, dass Mäuse mit Nf1-null-Schwann-Zellen und Nf1-Haploinsuffizienz in allen anderen Zelltypen (Krox20-Cre;Nf1^flox/- Mäuse) entwickelten plexiformen Neurofibromen deuteten darauf hin, dass eine reduzierte Nf1-Gendosis in zusätzlichen Zelltypen für die Neurofibrom-Pathogenese erforderlich war⁸. Selbst dann sind die plexiformen Neurofibrome in Krox20-Cre; Nf1^flox/- Mäuse entwickelten sich nicht zu MPNSTs und ahmten daher die Biologie ihrer menschlichen Gegenstücke nur teilweise nach. Die MPNST-Pathogenese trat auf, wenn Nf1-Mutationen mit Mutationen in zusätzlichen Tumorsuppressorgenen wie Trp53⁹ oder Cdkn2a¹⁰ verpartnert wurden, aber MPNSTs in diesen GEM-Modellen entwickelten sich de novo oder aus atypischen neurofibromatösen Neoplasien mit unsicherem biologischem Potenzial (ANNUBPs)^11,12 und nicht aus bereits bestehenden gutartigen plexiformen Neurofibromen (siehe ^13,14 für hervorragende Übersichten dieser Modelle sowie anderer Modelle, die zusätzliche MPNST-assoziierte Funktionsverlustmutationen in Genen wie Suz12 und Pten¹⁵ einführen).

Diese Mausmodelle waren von unschätzbarem Wert für die Etablierung der Rolle, die Gene wie NF1, TP53 und CDKN2A bei der Pathogenese von NF1-assoziierten Neoplasien des peripheren Nervensystems spielen, und für präklinische Studien zur Erprobung von Therapeutikakandidaten. Wir haben jedoch immer noch ein unvollständiges Verständnis des Prozesses, durch den plexiforme Neurofibrome zu atypischen neurofibromatösen Neoplasien mit ungewissem biologischem Potenzial (ANNUBPs¹⁶) und dann zu MPNSTs fortschreiten. In letzter Zeit wurden einige Fortschritte beim Verständnis dieses Prozesses erzielt, mit dem jüngsten Bericht, dass Mäuse mit Deletionen in Nf1 und Arf ANNUBPs entwickeln, die zu MPNSTs¹¹ fortschreiten. Es gibt jedoch noch keine auf Nf1-Mutationen basierenden Mausmodelle, die den Prozess der plexiformen Neurofibrom-MPNST-Progression beim Menschen vollständig rekapitulieren. Darüber hinaus ist nicht klar, ob es mehrere unterschiedliche Wege gibt, die zur Entwicklung von MPNSTs führen. Vor diesem Hintergrund ist es möglich, dass die oben beschriebenen GEMs nur eine Teilmenge mehrerer verschiedener Signalwege modellieren, die zur Neurofibrom-MPNST-Progression und MPNST-Pathogenese führen. Dieser Punkt wird durch die Tatsache unterstrichen, dass MPNSTs auch sporadisch auftreten und dass einige sporadische MPNSTs anscheinend keine NF1-Mutationen aufweisen^17,18.

Obwohl dieser letzte Punkt durch den jüngsten Vorschlag von Magollon-Lorenz et al. in Frage gestellt wurde, dass zumindest einige sporadische MPNSTs ohne NF1-Mutationen Melanome oder eine andere Art von Sarkom¹⁹ sind, haben wir kürzlich über ein sporadisches MPNST und eine von diesem Tumor abgeleitete Zelllinie (2XSB-Zellen) berichtet, die NF1-Wildtyp ²⁰ war. Bei der Charakterisierung des Muttertumors und der 2XSB-Zelllinie schlossen wir systematisch alternative diagnostische Möglichkeiten aus, einschließlich des Melanoms und der zahlreichen anderen Sarkomtypen, die routinemäßig bei der Differentialdiagnose eines sporadischen malignen peripheren Nervenscheidentumors in Betracht gezogen werden²⁰. Darüber hinaus stellen wir fest, dass Magollon-Lorenz et al. einräumten, dass ihre Ergebnisse in den drei von ihnen untersuchten sporadischen MPNST-Zelllinien nicht verallgemeinert werden konnten, um darauf hinzuweisen, dass alle Tumoren, die als sporadische MPNSTs identifiziert wurden, keine MPNSTs sind.

Um ein GEM-Modell zu konstruieren, in dem Neurofibrom und MPNST-Pathogenese nicht unbedingt von spezifischen Tumorsuppressorgenmutationen abhängig sind, erzeugten wir transgene Mäuse, in denen die Überexpression des potenten Schwann-Zell-Mitogens Neuregulin-1 (NRG1) durch den Schwann-Zell-spezifischen Myelinprotein-Null-Promotor (P_{0-GGFβ3-Mäuse}) angetrieben ^wurde21. Wir haben bereits gezeigt, dass humane Neurofibrome, MPNSTs und MPNST-Zelllinien mehrere NRG1-Isoformen zusammen mit den erbB-Rezeptor-Tyrosinkinasen (erbB2, erbB3 und erbB4) exprimieren, die die NRG1-Signalgebung vermitteln, und dass diese erbB-Rezeptoren konstitutiv aktiviert sind²². Wir haben auch gezeigt, dass pharmakologische Inhibitoren der erbB-Kinasen die MPNST-Proliferation²², das Überleben²³ und die Migration²⁴ stark hemmen. In Übereinstimmung mit unseren Beobachtungen beim Menschen entwickeln P 0-GGFβ3-Mäuse plexiforme Neurofibrome²⁵, die sich mit hoher Frequenz zu MPNSTs entwickeln ^21,25. Wir haben gezeigt, dass P 0-GGFβ3-MPNSTs, wie ihre menschlichen Gegenstücke, häufig Mutationen von Trp53 und Cdkn2a sowie zahlreiche andere genomische Anomalien entwickeln, die möglicherweise zur Tumorgenese beitragen²⁵. MPNSTs, die in P 0-GGFβ3-Mäusen auftreten, weisen keine inaktivierenden Nf1-Mutationen auf. Unter Verwendung genetischer Komplementierung konnten wir jedoch zeigen, dass NRG1 die Tumorgenese in P 0-GGFβ3-Mäusen hauptsächlich durch dieselben Signalkaskaden fördert, die durch den Verlust von Nf1 verändert werden²⁶; Diese Schlussfolgerung basiert auf unserer Erkenntnis, dass die Substitution der NRG1-Überexpression durch den Nf1-Verlust bei Vorliegen einer Trp53-Haploinsuffizienz (P _0-GGFβ3;Trp53^+/- Mäuse) produziert Tiere, bei denen sich MPNSTs de novo entwickeln, wie es bei cis-Nf1^+/- der Fall ist; Trp53^+/- Mäuse²⁷.

Um diese und andere Informationen zu erhalten, die zeigen, dass P 0-GGFβ3-Mäuse die Prozesse der Neurofibrom-Pathogenese und der Neurofibrom-MPNST-Progression, die bei Menschen mit NF1 beobachtet werden, genau modellieren, haben wir spezielle Methoden entwickelt, um Gewebe von diesen Tieren zu verarbeiten, ihre Tumore genau zu diagnostizieren, die in diesen Mäusen auftretenden MPNSTs zu bewerten, P_0-GGFβ3 und P_0-GGFβ3 in der frühen Passage zu etablieren und zu charakterisieren; Trp53^+/- MPNST-Kulturen und kritischer Vergleich der Pathologie von P 0-GGFβ3 PNs und MPNSTs und P_0-GGFβ3; Trp53^+/- MPNSTs mit denen ihrer menschlichen Gegenstücke. Viele dieser Methoden sind auf andere GEM-Modelle von Neoplasien des Nervensystems verallgemeinerbar. Darüber hinaus sind einige dieser Methoden breiter auf GEM-Modelle anwendbar, in denen Neoplasien an anderen Organstellen auftreten. Daher präsentieren wir hier eine detaillierte Beschreibung dieser Methoden.

Protocol

Die hier beschriebenen Verfahren wurden von der IACUC der Medical University of South Carolina genehmigt und von ordnungsgemäß geschultem Personal in Übereinstimmung mit dem NIH-Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren und den institutionellen Tierpflegerichtlinien des MUSC durchgeführt. 1. Bestimmung der Tumorpenetranz und des Überlebens in P 0-GGFβ3-Mäusen und Identifizierung von Tumoren in diesen Tieren zur weiteren Charakterisierung …

Representative Results

Abbildung 2 zeigt Beispiele für grob offensichtliche Neoplasien, die bei P 0-GGFβ3-Mäusen auftreten. Tumoren, die mit bloßem Auge leicht zu erkennen sind, können als Massen gesehen werden, die sich in Körperregionen ausdehnen, wie in Abbildung 2A (Pfeil) dargestellt. Bei der Bestimmung, ob es sich bei dem Neoplasma möglicherweise um einen peripheren Nervenscheidentumor handelt, muss unbedingt festgestellt werden, dass der Tumor mit einem periph…

Discussion

Die hier vorgestellten histologischen und biochemischen Methoden bieten einen Rahmen für die Diagnose und Charakterisierung von GEM-Modellen des Neurofibroms und der MPNST-Pathogenese. Im Laufe der Jahre haben wir festgestellt, dass diese Methoden sehr nützlich sind, um die Pathologie von peripheren Nervenscheidentumoren zu beurteilen, die in GEM-Modellen auftreten 21,25,26. Während die hier skizzierten Protokolle nützlich s…

Materials

100 mm Tissue Culture Plates	Corning Falcon	353003
3, 3'- Diaminobensidine (DAB)	Vector Laboratories	SK-400
6- well plates	Corning Costar	3516
Acetic Acid	Fisher Scientific	A38-212
Alexa Fluor 488 Secondary (Goat Anti-Mouse)	Invitrogen	A11029
Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Mouse)	Invitrogen	A21043 or A11004
Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Rabbit)	Invitrogen	A11036
Ammonium Chloride (NH4Cl)	Fisher Scientific	A661-500
BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225
Bovine Serum Albumin	Fisher Scientific	BP1600-100
Caldesmon	ABCAM	E89, ab32330
CD117	Cell Marque	117R-18-ASR
CD163	Leica	NCL-L-CD163
CD31	ABCAM	ab29364
CD34	ABCAM	ab81289
CD86	ABCAM	ab53004
Cell Scraper	Sarstedt	83.183
Cell Stripper	Corning	25-056-CI
Circle Coverslip	Fisher Scientific	12-545-100
Citrisolve Hybrid (d-limonene-based solvent)	Decon Laboratories	5989-27-5
Critic Acid	Fisher Scientific	A104-500
Cytokeratin	ABCAM	C-11, ab7753
Desmin	Agilent Dako	clone D33 (M0760)
Diaminobensizdine (DAB) Solution	Vector Laboratories	SK-4100
DMEM	Corning	15-013-CV
Eosin Y	Thermo Scientific	7111
Ethanol (200 Proof)	Decon Laboratories	2716
Fetal Calf Serum	Omega Scientific	FB-01
Forksolin	Sigma-Aldrich	F6886
Glycerol	Sigma-Aldrich	G6279
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Corning	21-022-CV
Harris Hematoxylin	Fisherbrand	245-677
Hemacytometer	Brightline-Hauser Scientific	1490
Hydrochloric Acid	Fisher Scientific	A144-212
Hydrogen Peroxide	Fisher Scientific	327-500
Iba1	Wako Chemicals	019-19741
ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit ,Mouse on Mouse	Vector Laboratories	MP-2400
ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit, Horse Anti-Rabbit	Vector Laboratories	MP-7401
Incubator	Thermo Scientific	Heracell 240i CO2 incubator
Isoflurane	Piramal	NDC 66794-017-25
Isopropanol	Fisher Scientific	A415
Ki-67	Cell Signaling	12202
Laminin	Thermo Fisher Scientific	23017015
Liquid Nitrogen
MART1	ABCAM	M2-9E3, ab187369
Microtome
Nestin	Millipore	Human: MAD5236 (10C2), Human:MAB353 (Rat-401)
Neuregulin 1 beta	In house	Made by S.L.C. (also available as 396-HB-050/CF from R&D Systems)
Neurofibromin	Santa Cruz Biotechnology	sc-67
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ mice	Jackson Laboratory	5557
Nonfat Dry Milk	Walmart	Great Value Brand
P0-GGFβ3 mice	In house
Paraffin Wax	Leica	Paraplast 39601006
Parafilm M	Sigma-Aldrich	PM-999
Paraformaldehyde (4%)	Thermo Scientific	J19943-K2
Permount (Xylene Mounting Medium)	Fisher Scientific	SP15-100
pH Meter	Mettler Toldedo	Seven Excellence, 8603
Phosphate Buffered Saline (Dulbecco's)	Corning	20-031-CV
PMEL	ABCAM	EP4863(2), ab137078
Poly-L-Lysine Hydrobromide	Sigma-Aldrich	P5899-5MG
Portable Isoflurance Machine	VetEquip Inhalation Anesthesia Systems
PVA-DABCO (Aqueous Mounting Medium)	Millipore Sigma	10981100ML
Rice Cooker	Beech Hamilton
S100B	Agilent Dako	Z0311  (now GA504)
SMA	Ventana Medical Systems	clone 1A4
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S640
Sodium Citrate (Dihydrate)	Fisher Scientific	BP327-1
Sox10	ABCAM	ab212843
Steel histology mold
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
TCF4/TCFL2	Cell Signaling	(CH48H11) #2569
Tissue Cassette
Toluidine Blue	ACROS Organics	348600050
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-500
TRIzol	Invitrogen	15596026
Trypsin	Corning	25-051-31