Identification, diagnostic et classification des tumeurs malignes de la gaine des nerfs périphériques dans des modèles murins génétiquement modifiés

Summary

Nous avons développé une méthodologie pour évaluer si les néoplasmes du système nerveux chez les souris génétiquement modifiées récapitulent avec précision la pathologie de leurs homologues humains. Ici, nous appliquons ces techniques histologiques, des critères pathologiques définis et des méthodologies de culture aux neurofibromes et aux tumeurs malignes de la gaine nerveuse périphérique survenant dans le modèle murin P 0-GGFβ3.

Abstract

Les patients atteints du syndrome de susceptibilité tumorale autosomique dominante neurofibromatose de type 1 (NF1) développent généralement des neurofibromes plexiformes (NP) qui se transforment ensuite en tumeurs malignes de la gaine nerveuse périphérique (MPNST) très agressives. La compréhension du processus par lequel une NP se transforme en MPNST serait facilitée par la disponibilité de modèles de souris génétiquement modifiées (GEM) qui reproduisent avec précision la progression PN-MPNST observée chez les humains atteints de NF1. Malheureusement, les modèles GEM avec ablation Nf1 ne récapitulent pas complètement ce processus. Cela nous a amenés à développer des souris P 0-GGFβ3, un modèle GEM dans lequel la surexpression de la neuréguline mitogène des cellules de Schwann (NRG1) dans les cellules de Schwann entraîne le développement de PN qui progressent pour devenir des MPNST à haute fréquence. Cependant, pour déterminer si la tumorigenèse et la progression néoplasique chez les souris P 0-GGFβ3 modélisent avec précision les processus observés chez les patients NF1, nous avons d’abord dû prouver que la pathologie des tumeurs de la gaine nerveuse périphérique P_0-GGFβ3 récapitule la pathologie de leurs homologues humains.

Ici, nous décrivons les méthodologies spécialisées utilisées pour diagnostiquer et classer avec précision les néoplasmes du système nerveux périphérique dans des modèles GEM, en utilisant P 0-GGFβ3 et P_0-GGFβ3 ; Les souris Trp53^+/- par exemple. Nous décrivons les méthodes histologiques, immunohistochimiques et histochimiques utilisées pour diagnostiquer les NP et les MPNST, comment distinguer ces néoplasmes des autres types de tumeurs qui imitent leur pathologie, et comment classer ces néoplasmes. Nous discutons de l’établissement de cultures à passage précoce à partir de MPNST GEM, de la caractérisation de ces cultures par immunocytochimie et de la vérification de leur tumorigénicité par l’établissement d’allogreffes. Collectivement, ces techniques caractérisent la pathologie des NP et des MPNST qui surviennent dans les modèles GEM et comparent de manière critique la pathologie de ces tumeurs murines à leurs homologues humains.

Introduction

Au cours des trois dernières décennies, de nombreux laboratoires ont tenté de créer des modèles murins de cancers humains en introduisant des mutations associées au cancer humain dans le génome de la souris ou en surexprimant un produit génique surexprimé dans les cancers humains. Les modèles de souris génétiquement modifiées (GEM) qui en résultent peuvent être utilisés à diverses fins, telles que l’établissement que la modification génomique nouvellement introduite initie la tumorigenèse, l’identification d’autres changements génétiques ou épigénétiques ultérieurs qui contribuent à la progression tumorale et la définition des voies de signalisation clés qui conduisent à l’initiation et à la progression de la tumeur. Contrairement aux modèles de xénogreffes orthotopiques, qui reposent sur l’utilisation de souris immunodéficientes, les modèles de cancer GEM ont un système immunitaire entièrement fonctionnel et modélisent donc plus précisément les réponses aux agents thérapeutiques candidats. Cependant, lorsqu’ils utilisent des modèles de cancer GEM à des fins comme celles-ci, il est essentiel que les chercheurs confirment que les observations faites avec les néoplasmes GEM sont pertinentes pour leurs homologues humains. Cette validation doit inclure une évaluation approfondie de la pathologie des tumeurs GEM et une détermination quant à savoir si les caractéristiques pathologiques des tumeurs GEM récapitulent la pathologie du type de tumeur humaine correspondant.

Le syndrome de susceptibilité tumorale neurofibromatose de type 1 (NF1) est la maladie génétique la plus courante affectant le système nerveux humain, survenant dans environ 1 naissance vivante sur 3 000 à 3 500 ^1,2,3. Les personnes atteintes de NF1 développent de multiples tumeurs bénignes de la gaine nerveuse périphérique appelées neurofibromes dans leur peau (neurofibromes dermiques) et dans les gros nerfs et plexus nerveux (neurofibromes plexiformes). Alors que les neurofibromes dermiques et plexiformes aggravent la qualité de vie du patient en produisant des troubles physiques, comportementaux et/ou sociaux, les neurofibromes plexiformes (NP) sont particulièrement dangereux ^4,5. En effet, les NP se transforment fréquemment en tumeurs malignes de la gaine nerveuse périphérique (MPNST), qui sont des néoplasmes agressifs à cellules fusiformes avec un taux de survie exceptionnellement faible ^1,2. Ce faible taux de survie est dû en grande partie à l’inefficacité des schémas radiothérapeutiques et chimiothérapeutiques actuellement utilisés pour traiter les TPNM. Cependant, le développement de nouvelles thérapies plus efficaces a été difficile. En effet, malgré la fréquence des MPNST chez les patients atteints de NF1, il s’agit toujours de tumeurs rares. En conséquence, il est très difficile d’obtenir un grand nombre de tumeurs humaines pour l’étude ; il est également difficile de recruter suffisamment de patients atteints de MPNST pour les essais cliniques. Pour surmonter ces limites, plusieurs modèles GEM ont été générés dans le but d’obtenir des informations supplémentaires sur les anomalies à l’origine de la pathogenèse du neurofibrome et de la progression du PN-MPNST et de faciliter les essais précliniques avec des agents thérapeutiques candidats.

Les patients atteints de NF1 présentent des mutations inactivatrices dans une copie du gène NF1. La pathogenèse du neurofibrome est déclenchée lorsqu’une mutation inactivatrice du gène NF1 fonctionnel restant se produit dans une cellule de la lignée cellulaire de Schwann. Étonnamment, cependant, lorsque des souris ont été générées avec des mutations inactivatrices de la lignée germinale Nf1, elles n’ont pas développé de neurofibromes ^6,7. La démonstration ultérieure que les souris avec des cellules de Schwann Nf1-null et une haploinsuffisance Nf1 dans tous les autres types de cellules (Krox20-Cre ;Nf1^flox/- souris) ont développé des neurofibromes plexiformes suggérant qu’une dose réduite du gène Nf1 dans d’autres types de cellules était nécessaire pour la pathogenèse du neurofibrome⁸. Même dans ce cas, les neurofibromes plexiformes de Krox20-Cre ; Les souris Nf1^flox/- n’ont pas progressé pour devenir des MPNST et n’ont donc que partiellement imité la biologie de leurs homologues humains. La pathogenèse des MPNST s’est produite lorsque les mutations de Nf1 étaient associées à des mutations dans d’autres gènes suppresseurs de tumeurs tels que Trp53⁹ ou Cdkn2a¹⁰, mais les MPNST dans ces modèles GEM se sont développés de novo ou à partir de néoplasmes neurofibromateux atypiques à potentiel biologique incertain (ANNUBPs)^11,12, plutôt que de neurofibromes plexiformes bénins préexistants (voir^13,14 pour d’excellentes revues de ces modèles ainsi que d’autres modèles introduisant des mutations de perte de fonction supplémentaires associées à MPNST dans des gènes tels que Suz12 et Pten¹⁵).

Ces modèles murins ont été inestimables pour établir le rôle que jouent des gènes tels que NF1, TP53 et CDKN2A dans la pathogenèse des néoplasmes du système nerveux périphérique associés à la NF1 et pour les essais précliniques testant des agents thérapeutiques candidats. Cependant, nous avons encore une compréhension incomplète du processus par lequel les neurofibromes plexiformes évoluent pour devenir des néoplasmes neurofibromateux atypiques à potentiel biologique incertain (ANNUPP¹⁶) puis des MPNST. Des progrès ont récemment été réalisés dans la compréhension de ce processus avec le rapport récent selon lequel des souris présentant des délétions dans Nf1 et Arf développent des ANNUBP qui progressent pour devenir des MPNST¹¹. Cependant, il n’existe pas encore de modèles murins basés sur la mutation Nf1 qui récapitulent entièrement le processus de progression du neurofibrome plexiforme-MPNST observé chez l’homme. De plus, il n’est pas clair s’il existe plusieurs voies distinctes qui mènent au développement des MPNST. Compte tenu de cela, il est possible que les GEM décrits ci-dessus ne modélisent qu’un sous-ensemble de plusieurs voies différentes qui conduisent à la progression du neurofibrome-MPNST et à la pathogenèse du MPNST. Ce point est souligné par le fait que les MPNST se produisent également sporadiquement et que certains MPNST sporadiques ne présentent apparemment pas de mutations NF1 ^17,18.

Bien que ce dernier point ait été remis en question par la récente suggestion de Magollon-Lorenz et al. selon laquelle au moins certains MPNST sporadiques dépourvus de mutations NF1 sont des mélanomes ou un type différent de sarcome¹⁹, nous avons récemment rapporté un MPNST sporadique et une lignée cellulaire dérivée de cette tumeur (cellules 2XSB) qui était de type sauvage NF1 ²⁰. Lors de la caractérisation de la tumeur mère et de la lignée cellulaire 2XSB, nous avons systématiquement exclu les possibilités de diagnostic alternatives, y compris le mélanome et les multiples autres types de sarcomes qui sont systématiquement pris en compte dans le diagnostic différentiel d’une tumeur maligne sporadique de la gaine nerveuse périphérique²⁰. De plus, nous notons que Magollon-Lorenz et al. ont reconnu que leurs résultats dans les trois lignées cellulaires MPNST sporadiques qu’ils ont étudiées ne pouvaient pas être généralisés pour indiquer que toutes les tumeurs identifiées comme MPNST sporadiques ne sont pas des MPNST.

Pour construire un modèle GEM dans lequel le neurofibrome et la pathogenèse du MPNST ne dépendaient pas nécessairement de mutations spécifiques du gène suppresseur de tumeur, nous avons généré des souris transgéniques chez lesquelles la surexpression de la puissante neuréguline-1 mitogène à cellules de Schwann (NRG1) était entraînée par le promoteur de la protéine de myéline zéro (P₀) spécifique à la cellule de Schwann (souris P 0-GGFβ3)²¹. Nous avons précédemment montré que les neurofibromes humains, les MPNST et les lignées cellulaires MPNST expriment plusieurs isoformes de NRG1 avec les tyrosines kinases du récepteur erbB (erbB2, erbB3 et erbB4) qui médient la signalisation NRG1 et que ces récepteurs erbB sont activés de manière constitutive²². Nous avons également démontré que les inhibiteurs pharmacologiques des kinases erbB inhibent puissamment la prolifération des MPNST²², la survie²³ et la migration²⁴. Conformément à nos observations chez l’homme, les souris P 0-GGFβ3 développent des neurofibromes plexiformes²⁵ qui évoluent pour devenir des MPNST à une fréquence élevée^21,25. Nous avons montré que les MPNST P 0-GGFβ3, comme leurs homologues humains, développent couramment des mutations de Trp53 et Cdkn2a, ainsi que de nombreuses autres anomalies génomiques qui contribuent potentiellement à la tumorigenèse²⁵. Les MPNST apparaissant chez les souris P 0-GGFβ3 ne présentent pas de mutations inactivatrices de Nf1. Cependant, en utilisant la complémentation génétique, nous avons montré que NRG1 favorise la tumorigenèse chez les souris P 0-GGFβ3 principalement par les mêmes cascades de signalisation qui sont altérées par la perte de Nf1 ²⁶ ; cette conclusion est basée sur notre constat que la substitution de la surexpression de NRG1 à la perte de Nf1 en présence d’une haploinsuffisance Trp53 (P 0-GGFβ3 ;Trp53^+/- souris) produit des animaux chez lesquels les MPNST se développent de novo, comme on le voit chez cis-Nf1^+/- ; Trp53^{+/- souris 27}.

Pour obtenir cette information et d’autres démontrant que les souris P 0-GGFβ3 modélisent avec précision les processus de pathogenèse du neurofibrome et de progression du neurofibrome-MPNST observés chez les humains atteints de NF1, nous avons développé des méthodologies spécialisées pour traiter les tissus de ces animaux, diagnostiquer avec précision leurs tumeurs, classer les MPNST apparaissant chez ces souris, établir et caractériser le passage précoce de P_0-GGFβ3 et P_0-GGFβ3 ; Trp53^+/- MPNST et comparaison critique de la pathologie des PN et MPNST de P 0-GGFβ3 et de P_0-GGFβ3 ; Trp53^+/- MPNST à celui de leurs homologues humains. Beaucoup de ces méthodologies sont généralisables à d’autres modèles GEM de néoplasie du système nerveux. De plus, plusieurs de ces méthodologies sont plus largement applicables aux modèles GEM dans lesquels les néoplasmes apparaissent dans d’autres sites d’organes. Par conséquent, nous présentons ici une description détaillée de ces méthodologies.

Protocol

Les procédures décrites ici ont été approuvées par l’IACUC de l’Université médicale de Caroline du Sud et ont été effectuées par du personnel correctement formé conformément au Guide des NIH pour les soins et l’utilisation des animaux de laboratoire et aux directives institutionnelles de MUSC en matière de soins aux animaux. 1. Détermination de la pénétrance tumorale et de la survie chez les souris P 0-GGFβ3 et identification des tumeurs chez ces animaux…

Representative Results

La figure 2 illustre des exemples de néoplasmes très évidents survenant chez les souris P 0-GGFβ3. Les tumeurs facilement identifiables à l’œil nu peuvent être vues comme des masses distendant des régions du corps, comme le montre la figure 2A (flèche). Pour déterminer si le néoplasme est potentiellement une tumeur de la gaine nerveuse périphérique, il est essentiel d’établir que la tumeur est associée à un nerf périphérique. Dan…

Discussion

Les méthodes histologiques et biochimiques présentées ici fournissent un cadre pour diagnostiquer et caractériser les modèles GEM du neurofibrome et de la pathogenèse MPNST. Au fil des ans, nous avons constaté que ces méthodologies étaient très utiles pour évaluer la pathologie des tumeurs de la gaine nerveuse périphérique apparaissant dans les modèles GEM 21,25,26. Cependant, bien que les protocoles décrits ici s…

Materials

100 mm Tissue Culture Plates	Corning Falcon	353003
3, 3'- Diaminobensidine (DAB)	Vector Laboratories	SK-400
6- well plates	Corning Costar	3516
Acetic Acid	Fisher Scientific	A38-212
Alexa Fluor 488 Secondary (Goat Anti-Mouse)	Invitrogen	A11029
Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Mouse)	Invitrogen	A21043 or A11004
Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Rabbit)	Invitrogen	A11036
Ammonium Chloride (NH4Cl)	Fisher Scientific	A661-500
BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225
Bovine Serum Albumin	Fisher Scientific	BP1600-100
Caldesmon	ABCAM	E89, ab32330
CD117	Cell Marque	117R-18-ASR
CD163	Leica	NCL-L-CD163
CD31	ABCAM	ab29364
CD34	ABCAM	ab81289
CD86	ABCAM	ab53004
Cell Scraper	Sarstedt	83.183
Cell Stripper	Corning	25-056-CI
Circle Coverslip	Fisher Scientific	12-545-100
Citrisolve Hybrid (d-limonene-based solvent)	Decon Laboratories	5989-27-5
Critic Acid	Fisher Scientific	A104-500
Cytokeratin	ABCAM	C-11, ab7753
Desmin	Agilent Dako	clone D33 (M0760)
Diaminobensizdine (DAB) Solution	Vector Laboratories	SK-4100
DMEM	Corning	15-013-CV
Eosin Y	Thermo Scientific	7111
Ethanol (200 Proof)	Decon Laboratories	2716
Fetal Calf Serum	Omega Scientific	FB-01
Forksolin	Sigma-Aldrich	F6886
Glycerol	Sigma-Aldrich	G6279
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Corning	21-022-CV
Harris Hematoxylin	Fisherbrand	245-677
Hemacytometer	Brightline-Hauser Scientific	1490
Hydrochloric Acid	Fisher Scientific	A144-212
Hydrogen Peroxide	Fisher Scientific	327-500
Iba1	Wako Chemicals	019-19741
ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit ,Mouse on Mouse	Vector Laboratories	MP-2400
ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit, Horse Anti-Rabbit	Vector Laboratories	MP-7401
Incubator	Thermo Scientific	Heracell 240i CO2 incubator
Isoflurane	Piramal	NDC 66794-017-25
Isopropanol	Fisher Scientific	A415
Ki-67	Cell Signaling	12202
Laminin	Thermo Fisher Scientific	23017015
Liquid Nitrogen
MART1	ABCAM	M2-9E3, ab187369
Microtome
Nestin	Millipore	Human: MAD5236 (10C2), Human:MAB353 (Rat-401)
Neuregulin 1 beta	In house	Made by S.L.C. (also available as 396-HB-050/CF from R&D Systems)
Neurofibromin	Santa Cruz Biotechnology	sc-67
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ mice	Jackson Laboratory	5557
Nonfat Dry Milk	Walmart	Great Value Brand
P0-GGFβ3 mice	In house
Paraffin Wax	Leica	Paraplast 39601006
Parafilm M	Sigma-Aldrich	PM-999
Paraformaldehyde (4%)	Thermo Scientific	J19943-K2
Permount (Xylene Mounting Medium)	Fisher Scientific	SP15-100
pH Meter	Mettler Toldedo	Seven Excellence, 8603
Phosphate Buffered Saline (Dulbecco's)	Corning	20-031-CV
PMEL	ABCAM	EP4863(2), ab137078
Poly-L-Lysine Hydrobromide	Sigma-Aldrich	P5899-5MG
Portable Isoflurance Machine	VetEquip Inhalation Anesthesia Systems
PVA-DABCO (Aqueous Mounting Medium)	Millipore Sigma	10981100ML
Rice Cooker	Beech Hamilton
S100B	Agilent Dako	Z0311  (now GA504)
SMA	Ventana Medical Systems	clone 1A4
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S640
Sodium Citrate (Dihydrate)	Fisher Scientific	BP327-1
Sox10	ABCAM	ab212843
Steel histology mold
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
TCF4/TCFL2	Cell Signaling	(CH48H11) #2569
Tissue Cassette
Toluidine Blue	ACROS Organics	348600050
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-500
TRIzol	Invitrogen	15596026
Trypsin	Corning	25-051-31