माइक्रोट्यूबुल्स नेटवर्क की कल्पना करने के लिए ड्रोसोफिला लार्वा न्यूरोमस्कुलर जंक्शन और मांसपेशी कोशिकाओं का उपयोग करना
Summary
यहां, हम न्यूरोमस्कुलर जंक्शनों और मांसपेशियों की कोशिकाओं में सूक्ष्मनलिका नेटवर्क की कल्पना करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर के शक्तिशाली आनुवंशिक उपकरणों के साथ संयुक्त, यह प्रोटोकॉल तंत्रिका तंत्र में सूक्ष्मनलिका नेटवर्क नियामक प्रोटीन की भूमिका के लिए आनुवंशिक स्क्रीनिंग और सूक्ष्मनलिका-गतिशीलता विश्लेषण की सुविधा प्रदान करता है।
Abstract
सूक्ष्मनलिका नेटवर्क तंत्रिका तंत्र का एक आवश्यक घटक है। कई सूक्ष्मनलिकाएं नियामक प्रोटीन में उत्परिवर्तन न्यूरोडेवलपमेंटल विकारों और न्यूरोलॉजिकल रोगों से जुड़े होते हैं, जैसे कि सूक्ष्मनलिका से जुड़े प्रोटीन ताऊ से न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग, सूक्ष्मनलिका सेवरिंग प्रोटीन स्पास्टिन और कैटानिन 60 क्रमशः वंशानुगत स्पास्टिक पैरापलेजिया और न्यूरोडेवलपमेंटल असामान्यताएं पैदा करते हैं। न्यूरॉन्स में सूक्ष्मनलिका नेटवर्क का पता लगाना न्यूरोलॉजिकल विकारों के रोगजनन को स्पष्ट करने के लिए फायदेमंद है। हालांकि, न्यूरॉन्स का छोटा आकार और अक्षीय सूक्ष्मनलिका बंडलों की घनी व्यवस्था सूक्ष्मनलिका नेटवर्क को चुनौतीपूर्ण बनाती है। इस अध्ययन में, हम ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर में सूक्ष्मनलिका नेटवर्क की कल्पना करने के लिए लार्वा न्यूरोमस्कुलर जंक्शन और मांसपेशियों की कोशिकाओं के विच्छेदन के साथ-साथ α-ट्यूबुलिन और सूक्ष्मनलिका से जुड़े प्रोटीन फुटश के इम्यूनोस्टेनिंग के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं। न्यूरोमस्कुलर जंक्शन हमें प्री-और पोस्ट-सिनैप्टिक सूक्ष्मनलिकाएं दोनों का निरीक्षण करने की अनुमति देता है, और ड्रोसोफिला लार्वा में मांसपेशियों की कोशिकाओं का बड़ा आकार सूक्ष्मनलिका नेटवर्क के स्पष्ट विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है। यहां, ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर में कैटनिन 60 को उत्परिवर्तित और अतिरंजित करके, और फिर न्यूरोमस्कुलर जंक्शन और मांसपेशियों की कोशिकाओं में सूक्ष्मनलिका नेटवर्क की जांच करके, हम न्यूरोडेवलपमेंट में कैटनिन 60 की नियामक भूमिका को सटीक रूप से प्रकट करते हैं। इसलिए, ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर के शक्तिशाली आनुवंशिक उपकरणों के साथ संयुक्त, यह प्रोटोकॉल तंत्रिका तंत्र में सूक्ष्मनलिका नेटवर्क नियामक प्रोटीन की भूमिका के लिए आनुवंशिक स्क्रीनिंग और सूक्ष्मनलिका गतिशीलता विश्लेषण की सुविधा प्रदान करता है।
Introduction
माइक्रोट्यूबुल्स (एमटी), साइटोस्केलेटन के संरचनात्मक घटकों में से एक के रूप में, कोशिका विभाजन, कोशिका विकास और गतिशीलता, इंट्रासेल्युलर परिवहन और सेल आकार के रखरखाव सहित विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। सूक्ष्मनलिका की गतिशीलता और कार्य को अन्य प्रोटीनों के साथ बातचीत द्वारा नियंत्रित किया जाता है, जैसे कि एमएपी 1, एमएपी 2, ताऊ, कैटानिन और काइन्सिन 1,2,3,4,5।
न्यूरॉन्स में, सूक्ष्मनलिकाएं अक्षतंतु और डेंड्राइट के विकास और रखरखाव के लिए आवश्यक हैं। सूक्ष्मनलिकाएं में असामान्यताएं शिथिलता और यहां तक कि न्यूरॉन्स की मृत्यु का कारण बनती हैं। उदाहरण के लिए, अल्जाइमर के रोगियों के मस्तिष्क में, ताऊ प्रोटीन हाइपरफॉस्फोराइलेशन सूक्ष्मनलिका नेटवर्क की स्थिरता को कम करता है, जिससे न्यूरोलॉजिकल अनियमितताएंहोती हैं। इस प्रकार, सूक्ष्मनलिका नेटवर्क की जांच न्यूरोडेवलपमेंट और न्यूरोलॉजिकल रोगों के रोगजनन की समझ में योगदान देगी।
न्यूरोमस्कुलर जंक्शन (एनएमजे) एक मोटर न्यूरॉन एक्सॉन टर्मिनल और एक मांसपेशी फाइबर के बीच गठित परिधीय सिनैप्स है, जो सिनैप्टिक संरचना और कार्योंका अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट और शक्तिशाली मॉडल प्रणाली है। फ्यूच ड्रोसोफिला में एक प्रोटीन है जो स्तनधारियों में पाए जाने वाले सूक्ष्मनलिका-बाध्यकारी प्रोटीन एमएपी 1 बी के समरूपहै। यह केवल न्यूरॉन्स में व्यक्त किया जाता है और एनएमजे के सिनैप्टिक बटन 8,9 के विकास में भूमिका निभाता है। जंगली-प्रकार में, एनएमजे प्रक्रियाओं के केंद्र के साथ चलने वाले फिलामेंटस बंडलों को एंटी-फुटश के साथ इम्यूनोस्टेनिंग द्वारा कल्पना की जाती है। एनएमजे के अंत तक पहुंचने पर, इस बंडल में या तो सूक्ष्मनलिकाएं युक्त एक लूप बनाने या इसकी फिलामेंटस संरचना को खोने की क्षमता होती है, जिसके परिणामस्वरूप एक फैलाव और तीक्ष्ण उपस्थिति10 होती है। माइक्रोट्यूबुल्स लूप रुके हुए विकास शंकु से जुड़े होते हैं, जिससे पता चलता है कि सूक्ष्मनलिका सरणी स्थिर है11. इसलिए, हम अप्रत्यक्ष रूप से फुटश स्टेनिंग द्वारा एनएमजे में स्थिर सूक्ष्मनलिका विकास निर्धारित कर सकते हैं। ड्रोसोफिला लार्वा में मांसपेशियों की कोशिकाओं का बड़ा आकार सूक्ष्मनलिका नेटवर्क के स्पष्ट विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है। सूक्ष्मनलिकाएं नेटवर्क की स्थिरता को प्रभावित करने वाले कारक सूक्ष्मनलिकाएं के घनत्व और आकार का विश्लेषण करके पाए जा सकते हैं। इसके साथ ही, मांसपेशियों की कोशिकाओं की सूक्ष्मनलिका नेटवर्क की स्थिति को अधिक व्यापक निष्कर्ष प्राप्त करने के लिए एनएमजे के परिणाम के साथ क्रॉस-सत्यापित किया जा सकता है।
सूक्ष्मनलिकाएं के नेटवर्क और गतिशीलता की जांच के लिए कई प्रोटोकॉल नियोजित किए गए हैं। हालांकि, इन शोधों ने अक्सर इन विट्रो अध्ययनों 12,13,14,15,16 पर ध्यान केंद्रित किया है। वैकल्पिक रूप से, विवो प्रयोगों में कुछ ने साइटोस्केलेटन17 का पता लगाने के लिए इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी को नियोजित किया है। प्रोटीन या डीएनए के लिए फ्लोरोसेंटली लेबल एंटीबॉडी या रासायनिक रंगों के विशिष्ट बंधन के अनुसार, यहां प्रस्तुत विधियां विवो में व्यक्तिगत न्यूरॉन्स के स्तर पर एनएमजे में सूक्ष्मनलिका नेटवर्क का पता लगाने की अनुमति देती हैं, जिसके परिणाम मांसपेशियों की कोशिकाओं में टिप्पणियों द्वारा पुष्टि की जाती है। ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर में उपलब्ध शक्तिशाली आनुवंशिक उपकरणों के साथ संयुक्त होने पर यह प्रोटोकॉल सरल, स्थिर और दोहराने योग्य है, जो विवो में तंत्रिका तंत्र में सूक्ष्मनलिका नेटवर्क नियामक प्रोटीन की भूमिका के लिए फेनोटाइपिक परीक्षाओं और आनुवंशिक स्क्रीनिंग की एक विविध श्रृंखला को सक्षम करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां ड्रोसोफिला लार्वा न्यूरोमस्कुलर जंक्शनों और मांसपेशियों की कोशिकाओं के विच्छेदन और इम्यूनोस्टेनिंग के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। विचार करने के लिए कई आवश्यक बिंदु हैं। सबसे पहल…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम पांडुलिपि पर चर्चा और टिप्पणियों के लिए डॉ यिंग जियोंग को धन्यवाद देते हैं। यह काम चीन के राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (एनएसएफसी) से सीएम (31500839) को अनुदान द्वारा समर्थित है।
Materials
| Alexa Fluor Plus 405 phalloidin | invitrogen | A30104 | dilute 1:200 |
| Enhanced Antifade Mounting Medium | Beyotime | P0128M | |
| FV10-ASW confocal microscope | Olympus | ||
| Goat anti-Mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated | Thermo Fisher | A-11001 | dilute 1:1,000 |
| Laser confocal microscope LSM 710 | Zeiss | ||
| Micro Scissors | 66vision | 54138B | |
| Mouse anti-Futsch antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 22C10 | dilute 1:50 |
| Mouse anti-α-tubulin antibody | Sigma | T5168 | dilute 1:1,000 |
| Paraformaldehyde | Wako | 168-20955 | Final concentration: 4% in PB Buffer |
| Stainless Steel Minutien Pins | Entomoravia | 0.1mm Diam | |
| Stereomicroscope SMZ161 | Motic | ||
| stereoscopic fluorescence microscope BX41 | Olympus | ||
| Texas Red-conjugated goat anti-HRP | Jackson ImmunoResearch | dilute 1:100 | |
| TO-PRO(R) 3 iodide | Invitrogen | T3605 | dilute 1:1,000 |
| Transfer decoloring shaker TS-8 | Kylin-Bell lab instruments | E0018 | |
| TritonX-100 | BioFroxx | 1139 | |
| Tweezers | dumont | 500342 |
Referências
- Halpain, S., Dehmelt, L. The MAP1 family of microtubule-associated proteins. Genome biology. 7 (6), 224 (2006).
- Sánchez, C., Díaz-Nido, J., Avila, J. Phosphorylation of microtubule-associated protein 2 (MAP2) and its relevance for the regulation of the neuronal cytoskeleton function. Progress in neurobiology. 61 (2), 133-168 (2000).
- Dehmelt, L., Halpain, S. The MAP2/Tau family of microtubule-associated proteins. Genome biology. 6 (1), 204 (2005).
- Roll-Mecak, A., McNally, F. J. Microtubule-severing enzymes. Current opinion in cell biology. 22 (1), 96-103 (2010).
- Walczak, C. E., Gayek, S., Ohi, R. Microtubule-depolymerizing kinesins. Annual review of cell and developmental biology. 29, 417-441 (2013).
- Bramblett, G. T., et al. Abnormal tau phosphorylation at Ser396 in Alzheimer’s disease recapitulates development and contributes to reduced microtubule binding. Neuron. 10 (6), 1089-1099 (1993).
- Van Vactor, D., Sigrist, S. J. Presynaptic morphogenesis, active zone organization and structural plasticity in Drosophila. Current opinion in neurobiology. 43, 119-129 (2017).
- Hummel, T., Krukkert, K., Roos, J., Davis, G., Klämbt, C. Drosophila Futsch/22C10 is a MAP1B-like protein required for dendritic and axonal development. Neuron. 26 (2), 357-370 (2000).
- Roos, J., Hummel, T., Ng, N., Klämbt, C., Davis, G. W. Drosophila Futsch regulates synaptic microtubule organization and is necessary for synaptic growth. Neuron. 26 (2), 371-382 (2000).
- Packard, M., et al. The Drosophila Wnt, wingless, provides an essential signal for pre- and postsynaptic differentiation. Cell. 111 (3), 319-330 (2002).
- Dent, E. W., Callaway, J. L., Szebenyi, G., Baas, P. W., Kalil, K. Reorganization and movement of microtubules in axonal growth cones and developing interstitial branches. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 19 (20), 8894-8908 (1999).
- Tanaka, E. M., Kirschner, M. W. Microtubule behavior in the growth cones of living neurons during axon elongation. The Journal of cell biology. 115 (2), 345-363 (1991).
- Ahmad, F. J., Yu, W., McNally, F. J., Baas, P. W. An essential role for katanin in severing microtubules in the neuron. The Journal of cell biology. 145 (2), 305-315 (1999).
- Hu, Z., et al. Fidgetin regulates cultured astrocyte migration by severing tyrosinated microtubules at the leading edge. Molecular biology of the cell. 28 (4), 545-553 (2017).
- Feizabadi, M. S., Castillon, V. J. The effect of Tau and taxol on polymerization of MCF7 microtubules in vitro. International journal of molecular sciences. 23 (2), 677 (2022).
- Velasco, C. D., et al. Microtubule depolymerization contributes to spontaneous neurotransmitter release in vitro. Communications biology. 6 (1), 488 (2023).
- Höög, J. L., et al. Electron tomography reveals a flared morphology on growing microtubule ends. Journal of cell science. 124, 693-698 (2011).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. Journal of neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).
- Broadie, K. S., Bate, M. Development of the embryonic neuromuscular synapse of Drosophila melanogaster. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 13 (1), 144-166 (1993).
- Xiong, Y., et al. HDAC6 mutations rescue human tau-induced microtubule defects in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (12), 4604-4609 (2013).
- Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. . Drosophila Protocols. , (2000).
- Mao, C. X., et al. Microtubule-severing protein Katanin regulates neuromuscular junction development and dendritic elaboration in Drosophila. Development. 141 (5), 1064-1074 (2014).
- Jin, S., et al. Drosophila Tubulin-specific chaperone E functions at neuromuscular synapses and is required for microtubule network formation. Development. 136 (9), 1571-1581 (2009).
- Sarthi, J., Elefant, F. dTip60 HAT activity controls synaptic bouton expansion at the Drosophila neuromuscular junction. PloS one. 6 (10), 26202 (2011).
- Weingarten, M. D., Lockwood, A. H., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. A protein factor essential for microtubule assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (5), 1858-1862 (1975).
- Kadavath, H., et al. Tau stabilizes microtubules by binding at the interface between tubulin heterodimers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (24), 7501-7506 (2015).
- Trotta, N., Orso, G., Rossetto, M. G., Daga, A., Broadie, K. The hereditary spastic paraplegia gene, spastin, regulates microtubule stability to modulate synaptic structure and function. Current biology: CB. 14 (13), 1135-1147 (2004).
