Usando a junção neuromuscular de larvas de Drosophila e células musculares para visualizar a rede de microtúbulos
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para visualizar as redes de microtúbulos nas junções neuromusculares e células musculares. Combinado com as poderosas ferramentas genéticas de Drosophila melanogaster, este protocolo facilita muito a triagem genética e a análise da dinâmica de microtúbulos para o papel das proteínas reguladoras da rede de microtúbulos no sistema nervoso.
Abstract
A rede de microtúbulos é um componente essencial do sistema nervoso. Mutações em muitas proteínas reguladoras dos microtúbulos estão associadas a distúrbios do neurodesenvolvimento e doenças neurológicas, tais como proteína Tau associada a microtúbulos a doenças neurodegenerativas, proteína cortadora de microtúbulos Spastin e Katanin 60 causam paraplegia espástica hereditária e anormalidades do neurodesenvolvimento, respectivamente. A detecção de redes de microtúbulos em neurônios é vantajosa para elucidar a patogênese de distúrbios neurológicos. No entanto, o pequeno tamanho dos neurônios e o arranjo denso dos feixes axonais de microtúbulos tornam a visualização das redes de microtúbulos um desafio. Neste estudo, descrevemos um método para dissecção da junção neuromuscular larval e células musculares, bem como imunomarcação de α-tubulina e proteína associada a microtúbulos Futsch para visualização de redes de microtúbulos em Drosophila melanogaster. A junção neuromuscular permite observar microtúbulos pré e pós-sinápticos, e o grande tamanho das células musculares na larva de Drosophila permite uma clara visualização da rede de microtúbulos. Aqui, ao mutar e superexpressar Katanin 60 em Drosophila melanogaster, e então examinar as redes de microtúbulos na junção neuromuscular e células musculares, revelamos com precisão o papel regulatório de Katanin 60 no neurodesenvolvimento. Portanto, combinado com as poderosas ferramentas genéticas de Drosophila melanogaster, este protocolo facilita muito a triagem genética e a análise da dinâmica de microtúbulos para o papel das proteínas reguladoras da rede de microtúbulos no sistema nervoso.
Introduction
Os microtúbulos (MTs), como um dos componentes estruturais do citoesqueleto, desempenham um papel importante em diversos processos biológicos, incluindo divisão celular, crescimento e motilidade celular, transporte intracelular e manutenção da forma celular. A dinâmica e a função dos microtúbulos são moduladas por interações com outras proteínas, como MAP1, MAP2, Tau, Katanin e Kinesin 1,2,3,4,5.
Nos neurônios, os microtúbulos são essenciais para o desenvolvimento e manutenção de axônios e dendritos. Anormalidades nos microtúbulos levam à disfunção e até mesmo à morte dos neurônios. Por exemplo, no cérebro de pacientes com Alzheimer, a hiperfosforilação da proteína Tau reduz a estabilidade da rede de microtúbulos, causando irregularidades neurológicas6. Assim, o exame das redes de microtúbulos contribuirá para a compreensão do neurodesenvolvimento e da patogênese das doenças neurológicas.
A junção neuromuscular (JNM) é a sinapse periférica formada entre um axônio terminal do neurônio motor e uma fibra muscular, que é um excelente e poderoso sistema modelo para o estudo da estrutura e funçõessinápticas7. Futsch é uma proteína de Drosophila homóloga à proteína de ligação a microtúbulos MAP1B encontrada em mamíferos8. É expressa apenas em neurônios e desempenha um papel no desenvolvimento dos botões sinápticos do NMJ 8,9. No tipo selvagem, feixes filamentosos que correm ao longo do centro dos processos NMJ são visualizados por imunomarcação com anti-Futsch. Ao atingir o final do NMJ, esse feixe tem a capacidade de formar uma alça constituída por microtúbulos ou de perder sua estrutura filamentosa, resultando em uma aparência difusa e puntiforme10. Alças de microtúbulos estão associadas a cones de crescimento pausados, o que sugere que a matriz de microtúbulos é estável11. Portanto, podemos determinar indiretamente o desenvolvimento de microtúbulos estáveis no NMJ pela coloração de Futsch. O grande tamanho das células musculares na larva de Drosophila permite uma visualização clara da rede de microtúbulos. Os fatores que afetam a estabilidade da rede de microtúbulos podem ser encontrados através da análise da densidade e forma dos microtúbulos. Simultaneamente, o estado da rede de microtúbulos das células musculares pode ser verificado de forma cruzada com o resultado do NMJ para obter conclusões mais abrangentes.
Muitos protocolos têm sido empregados para investigar a rede e a dinâmica dos microtúbulos. No entanto, essas pesquisas têm frequentemente se concentrado em estudos in vitro 12,13,14,15,16. Alternativamente, alguns experimentos in vivo têm empregado microscopia eletrônica para detectar o citoesqueleto17. De acordo com a ligação específica de anticorpos fluorescentemente marcados ou corantes químicos a proteínas ou DNA, os métodos aqui apresentados permitem a detecção de redes de microtúbulos em NMJ em nível de neurônios individuais in vivo, com resultados corroborados por observações em células musculares. Este protocolo é simples, estável e repetível quando combinado com as poderosas ferramentas genéticas disponíveis em Drosophila melanogaster, permitindo uma gama diversificada de exames fenotípicos e rastreios genéticos para o papel de proteínas reguladoras da rede de microtúbulos no sistema nervoso in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui é descrito um protocolo para a dissecção e imunomarcação de larvas de Drosophila , junções neuromusculares e células musculares. Há vários pontos essenciais a serem considerados. Em primeiro lugar, evitar a lesão dos músculos observados é crucial durante o processo de dissecção. Pode valer a pena fixar o filé antes de retirar os órgãos internos para evitar o contato direto entre a pinça e os músculos. Para evitar danos musculares ou separação da epiderme larval, é importante garantir …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Dr. Ying Xiong pelas discussões e comentários sobre o manuscrito. Este trabalho é apoiado por uma bolsa da National Science Foundation of China (NSFC) para C. M. (31500839).
Materials
| Alexa Fluor Plus 405 phalloidin | invitrogen | A30104 | dilute 1:200 |
| Enhanced Antifade Mounting Medium | Beyotime | P0128M | |
| FV10-ASW confocal microscope | Olympus | ||
| Goat anti-Mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated | Thermo Fisher | A-11001 | dilute 1:1,000 |
| Laser confocal microscope LSM 710 | Zeiss | ||
| Micro Scissors | 66vision | 54138B | |
| Mouse anti-Futsch antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 22C10 | dilute 1:50 |
| Mouse anti-α-tubulin antibody | Sigma | T5168 | dilute 1:1,000 |
| Paraformaldehyde | Wako | 168-20955 | Final concentration: 4% in PB Buffer |
| Stainless Steel Minutien Pins | Entomoravia | 0.1mm Diam | |
| Stereomicroscope SMZ161 | Motic | ||
| stereoscopic fluorescence microscope BX41 | Olympus | ||
| Texas Red-conjugated goat anti-HRP | Jackson ImmunoResearch | dilute 1:100 | |
| TO-PRO(R) 3 iodide | Invitrogen | T3605 | dilute 1:1,000 |
| Transfer decoloring shaker TS-8 | Kylin-Bell lab instruments | E0018 | |
| TritonX-100 | BioFroxx | 1139 | |
| Tweezers | dumont | 500342 |
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