Análisis multiómico de TMEM200A como biomarcador pancancerígeno
Summary
En este trabajo se presenta un protocolo en el que se combinan múltiples herramientas bioinformáticas para estudiar las funciones biológicas de TMEM200A en cáncer. Además, también validamos experimentalmente las predicciones bioinformáticas.
Abstract
Se sabe que la proteína transmembrana, TMEM200A, está asociada con cánceres humanos e infiltración inmunitaria. Aquí, evaluamos la función de TMEM200A en cánceres comunes mediante análisis multiómico y utilizamos cultivos celulares in vitro de células gástricas para verificar los resultados. La expresión de TMEM200A en varios tipos de cáncer humano se evaluó utilizando los datos de RNA-seq de la base de datos Xena de la UCSC. El análisis bioinformático reveló un papel potencial de TMEM200A como biomarcador diagnóstico y pronóstico.
Se cultivaron cultivos de líneas celulares gástricas y cancerosas normales y se eliminó TMEM200A se eliminó. Los niveles de expresión de TMEM200A se midieron mediante el uso de la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real y Western blot. A continuación, se utilizaron estudios de pérdida de función in vitro para determinar las funciones de TMEM200A en el comportamiento maligno y la formación tumoral de las células de cáncer gástrico (GC). Se utilizaron Western blots para evaluar el efecto del knockdown en la transición epitelio-mesenquimal (EMT) y la vía de señalización PI3K/AKT en GC. El análisis bioinformático mostró que TMEM200A se expresaba en niveles altos en GC.
La proliferación de las células GC fue inhibida por TMEM200A knockdown, que también disminuyó la vimentina, la N-cadherina y las proteínas Snai, e inhibió la fosforilación de AKT. La vía de señalización PI3K/AKT también parece estar implicada en la regulación mediada por TMEM200A del desarrollo de GC. Los resultados aquí presentados sugieren que TMEM200A regula el microambiente tumoral afectando a la EMT. TMEM200A también puede afectar a la EMT a través de la señalización PI3K/AKT, influyendo así en el microambiente tumoral. Por lo tanto, en los pancánceres, especialmente en los GC, TMEM200A puede ser un biomarcador y un oncogén potenciales.
Introduction
El cáncer se ha convertido en un problema persistente de salud pública que pone en peligro la salud humana en todo el mundo1debido a sus altas tasas de morbilidad y mortalidad en todo el mundo, lo que supone una pesada carga financiera y médica para la sociedad2. En los últimos años se han logrado avances significativos en la terapia del cáncer gracias al descubrimiento de marcadores de cáncer3, y los investigadores han desarrollado nuevos métodos de diagnóstico y nuevos fármacos para tratar el cáncer. Sin embargo, algunos pacientes con cáncer todavía tienen un pronóstico precario debido a factores como la resistencia a los medicamentos, los efectos secundarios de los medicamentos y la sensibilidad química4. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de identificar nuevos biomarcadores para el cribado y el tratamiento de los cánceres en estadio temprano5.
Las proteínas de membrana son proteínas que pueden unirse e integrarse en las membranas de las células y orgánulos6. Estas se pueden agrupar en tres categorías dependiendo de la fuerza de unión a la membrana y su localización: proteínas ancladas a lípidos, proteínas integrales y proteínas periféricas de membrana 7,8. Una proteína transmembrana (TMEM) es una proteína de membrana integral que consta de al menos un segmento transmembrana9, que pasa total o parcialmente a través de la membrana biológica.
Aunque los mecanismos de acción de las proteínas pertenecientes a la familia TMEM no se conocen bien, se sabe que estas proteínas están involucradas en varios tipos de cánceres10. Varias proteínas TMEM se asocian con fenotipos migratorios, proliferativos e invasivos, y su expresión a menudo se asocia con el pronóstico del paciente11. Por lo tanto, los miembros de la familia TMEM se han convertido en el objetivo de la investigación. Una revisión exhaustiva de los informes existentes sobre TMEM reveló que se asocian principalmente con la señalización inter e intracelular12, las enfermedades relacionadas con el sistema inmunitario y la tumorigénesis10. Muchos TMEM también poseen importantes funciones fisiológicas, por ejemplo, los canales iónicos en la membrana plasmática, la activación de las vías de transducción de señales, así como la mediación de la quimiotaxis celular, la adhesión, la apoptosis y la autofagia10. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que las proteínas TMEM pueden ser marcadores pronósticos importantes en la detección y el tratamiento de tumores.
TMEM200A expresión está significativamente elevada en el cáncer gástrico (CG). Una mayor expresión de TMEM200A13, que tiene ocho exones y una longitud total de 77,536 kb en el cromosoma 6q23.1, se ha relacionado con un mal pronóstico de supervivencia global (SG) en los casos de GC. Sin embargo, los cambios en su expresión rara vez se han reportado en estudios oncológicos. En este artículo se compara y analiza la utilidad de la TMEM200A como diana terapéutica y marcador diagnóstico tumoral en diversos estudios oncológicos utilizando diferentes conjuntos de datos disponibles públicamente. Evaluamos la efectividad de TMEM200A como biomarcador diagnóstico y pronóstico pancancerígeno, así como sus niveles de expresión en varios tipos de cáncer humano utilizando datos de RNA-seq de las bases de datos Xena y TCGA de la UCSC, así como mediante reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) y Western blot.
El efecto de los niveles de expresión de TMEM200A en las tasas de mutación, los procesos reguladores, el diagnóstico y pronóstico tumoral, la infiltración inmunitaria y la inmunoterapia se investigó más a fondo utilizando una combinación de herramientas computacionales y sitios web de conjuntos de datos. Se utilizaron las bases de datos CBioPortal y el Catálogo de Mutaciones Somáticas en Células Cancerosas (COSMIC) para examinar las mutaciones en TMEM200A. Se utilizaron los sitios web Sangerbox y TISIDB para comprender cómo influye la TMEM200A en la infiltración inmunitaria. Se utilizó la herramienta en línea Tumor Immune Single Cell Center (TISCH) y la base de datos CancerSEA para investigar la función de TMEM200A. Finalmente, para evaluar el impacto de la TMEM200A en el comportamiento maligno y la función de desarrollo tumoral de las células GC, se realizó un experimento de pérdida de función en un ensayo in vitro . Además, se realizó Western blot para evaluar cómo TMEM200A knockdown afectaba a la vía de señalización PI3K/AKT y a la transición epitelio-mesenquimal (EMT) en GC.
Protocol
Representative Results
Discussion
TMEM200A pertenece a una familia de TMEMs que es esencial para que las células cancerosas proliferen38. La expresión variable de TMEM200A en diferentes neoplasias malignas ha recibido menos atención y falta una investigación exhaustiva del pancáncer. Sin embargo, la evidencia continúa acumulándose, mostrando que la familia de proteínas transmembrana TMEM puede ser importante para mantener las células cancerosas malignas a través de interacciones con varias proteínas, p…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo contó con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82160550).
Materials
| Anti-AKT antibody | Proteintech Group, Inc | 60203-2-Ig | |
| Anti-E-cadherin antibody | Proteintech Group, Inc | 20874-1-AP | |
| anti-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) antibody | Proteintech Group, Inc | 10494-1-AP | |
| Anti-N-cadherin antibody | Proteintech Group, Inc | 22018-1-AP | |
| Anti-P-AKT antibody | Proteintech Group, Inc | 66444-1-Ig | |
| Anti-snail antibody | Proteintech Group, Inc | 13099-1-AP | |
| Anti-Vimentin antibody | Proteintech Group, Inc | 10366-1-AP | |
| AxyPrepMultisourceTotalRNAMini- prep Kit |
Suzhou Youyi Landi Biotechnology Co., Ltd | UEL-UE-MN-MS-RNA-50G | |
| BCA Protein Assay Kit | Epizyme Biotech | ZJ101L | |
| CCK-8 reagent | MedChemExpress | HY-K0301-500T | |
| Fetal bovine serum (FBS) | CYAGEN BIOSCIENCES (GUANGZHOU) INC | FBSSR-01021 | |
| GAPDH primer | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | Forward primer (5’-3’): TGACATCAAGAAGGTG GTGAAGCAG; Reverse primer (5’-3’): GTGTCGCTGTTGAAG TCAGAGGAG |
|
| HighGene plus Transfection reagent | ABclonal | RM09014P | |
| HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse lgG (H+L) | Proteintech Group, Inc | SA00001-1 | |
| HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit lgG (H+L) | Proteintech Group, Inc | SA00001-2 | |
| Human gastric mucosal epithelial GES-1 cells | Guangzhou Cellcook Biotech Co.,Ltd. | ||
| Human STAD HGC-27 cells | Procell Life Science&Technology Co.,Ltd | ||
| Human STAD SGC-7901 cells | Procell Life Science&Technology Co.,Ltd | ||
| MonAmp SYBR Green qPCR Mix (None ROX) | Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd | MQ10101S | |
| MonScript RTIII All-in-One Mix with dsDNase | Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd | MR05101M | |
| Omni-ECL Femto Light Chemiluminescence Kit | Epizyme Biotech | SQ201 | |
| PAGE Gel Fast Preparationb Kit | Epizyme Biotech | PG111 | |
| Penicillin-streptomycin (Pen-Strep) | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd | P1400-100 | |
| Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Merck KGaA | IPVH00010-1 | |
| Protein Free Rapid Blocking Buffer | Epizyme Biotech | PS108P | |
| RIPA lysis solution | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd | R0010 | |
| RPMI 1640 complete medium | Thermo Fisher Scientific | C11875500BT | |
| Skimmed milk | Campina: Elk | ||
| TBST buffer solution | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd | T1082 | |
| The protein loading buffer | Epizyme Biotech | LT101S | |
| TMEM200A knockdown plasmid | MiaoLing Plasmid | ||
| TMEM200A primer | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | Forward primer (5’-3’): AAGGCGGTGTGGTGGTTCG; Reverse primer (5’-3’): GATTTTGGTCTCTTTGTCACGGTT | |
| TMEM200A SiRNA1 | MiaoLing Plasmid | Forward primer (5’-3’): ACAACTGATGATAAGACCAG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGACTACTATTCTGGTC | |
| TMEM200A SiRNA2 | MiaoLing Plasmid | Forward primer (5’-3’): CGTGTGAATGTCAATGACTG; Reverse primer (5’-3’): GCACACTTACAGTTACTGAC | |
| TMEM200A SiRNA3 | MiaoLing Plasmid | Forward primer (5’-3’): ACAACCACAACATCTGCCCG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGGTGTTGTAGACGGGC | |
| Transmembrane protein 200A Antibody | Proteintech Group, Inc | 48081-1 | |
| Equipment | |||
| CO2 cell culture incubator | Haier Group | PYXE-80IR | |
| Electrophoresis instrument | Bio-RAD | ||
| Fluorescence quantitative PCR instrument | Bio-RAD | ||
| Gel Imaging System (Tanon 5200) | Tanon Science & Technology Co., Ltd | LAB-0002-0007-SHTN | |
| Multifunctional Enzyme Labeler | Berthold |
Referências
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