Estabelecendo um Modelo Fisiológico de Microtumor Vascularizado Humano para Pesquisa em Câncer
Summary
Este protocolo apresenta um modelo tumor-on-a-chip fisiologicamente relevante para realizar pesquisa básica e translacional de câncer humano de alto rendimento, rastreamento avançado de drogas, modelagem de doenças e abordagens de medicina personalizada com uma descrição de procedimentos de carregamento, manutenção e avaliação.
Abstract
A falta de modelos de câncer validados que recapitulem o microambiente tumoral de cânceres sólidos in vitro continua sendo um gargalo significativo para a pesquisa pré-clínica do câncer e o desenvolvimento terapêutico. Para superar esse problema, desenvolvemos o microtumor vascularizado (VMT), ou chip tumoral, um sistema microfisiológico que modela realisticamente o complexo microambiente tumoral humano. A VMT se forma de novo dentro de uma plataforma microfluídica por co-cultivo de vários tipos de células humanas sob condições dinâmicas e fisiológicas de fluxo. Esta construção microtumoral projetada por tecido incorpora uma rede vascular viva perfundida que suporta a massa tumoral em crescimento, assim como os vasos recém-formados fazem in vivo. É importante ressaltar que drogas e células imunes devem atravessar a camada endotelial para alcançar o tumor, modelando barreiras fisiológicas in vivo para liberação terapêutica e eficácia. Uma vez que a plataforma VMT é opticamente transparente, imagens de alta resolução de processos dinâmicos, como extravasamento de células imunes e metástases, podem ser obtidas com a visualização direta de células marcadas fluorescentemente dentro do tecido. Além disso, o VMT retém a heterogeneidade tumoral in vivo , assinaturas de expressão gênica e respostas a drogas. Praticamente qualquer tipo de tumor pode ser adaptado à plataforma, e as células primárias de tecidos cirúrgicos frescos crescem e respondem ao tratamento medicamentoso no VMT, abrindo caminho para uma medicina verdadeiramente personalizada. Aqui, os métodos para estabelecer o VMT e utilizá-lo para a pesquisa em oncologia são descritos. Essa abordagem inovadora abre novas possibilidades para o estudo de tumores e respostas a drogas, fornecendo aos pesquisadores uma ferramenta poderosa para avançar na pesquisa sobre o câncer.
Introduction
O câncer continua sendo um grande problema de saúde em todo o mundo e é a segunda causa de morte nos Estados Unidos. Somente para o ano de 2023, o Centro Nacional de Estatísticas de Saúde prevê mais de 1,9 milhão de novos casos de câncer e mais de 600.000 mortes por câncer ocorrendo nos EUA1, destacando a necessidade urgente de abordagens de tratamento eficazes. No entanto, atualmente, apenas 5,1% das terapêuticas anticâncer que entram em ensaios clínicos finalmente obtêm a aprovação da FDA. O fracasso de candidatos promissores em progredir com sucesso através de ensaios clínicos pode ser parcialmente atribuído ao uso de sistemas modelos não fisiológicos, como culturas 2D e esferoides, durante o desenvolvimento pré-clínico defármacos 2. Esses modelos clássicos de câncer carecem de componentes essenciais do microambiente tumoral, como nicho estromal, células imunes associadas e vasculatura perfundida, que são determinantes-chave da resistência terapêutica e progressão da doença. Assim, um novo sistema modelo que mimetize melhor o microambiente tumoral humano in vivo é necessário para melhorar a tradução clínica dos achados pré-clínicos.
O campo da engenharia de tecidos está avançando rapidamente, fornecendo métodos aprimorados para o estudo de doenças humanas em ambientes de laboratório. Um desenvolvimento significativo é o surgimento de sistemas microfisiológicos (MPS), também conhecidos como chips de órgãos ou chips de tecido, que são órgãos humanos funcionais, miniaturizados, capazes de replicar condições saudáveis ou doentes 3,4,5. Nesse contexto, chips tumorais, que são modelos tridimensionais de tumores humanos baseados em microfluídica in vitro, têm sido desenvolvidos para pesquisas em oncologia2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. Esses modelos avançados incorporam pistas bioquímicas e biofísicas dentro de um microambiente tumoral dinâmico, permitindo que os pesquisadores estudem o comportamento tumoral e as respostas a tratamentos em um contexto fisiologicamente mais relevante. No entanto, apesar desses avanços, poucos grupos incorporaram com sucesso uma vasculatura viva e funcional, particularmente uma que se autopadroniza em resposta ao fluxo fisiológico 3,4,5,6. A inclusão de uma rede vascular funcional é crucial, pois permite modelar barreiras físicas que afetam a liberação de drogas ou células, homing celular para microambientes distintos e migração transendotelial de células tumorais, estromais e imunes. Ao incluir essa característica, o chip tumoral pode representar melhor as complexidades observadas no microambiente tumoral in vivo.
Para atender a essa necessidade não atendida, desenvolvemos uma nova plataforma de triagem de fármacos que permite a formação de redes de microvasos dentro de um dispositivo microfluídico 8,9,10,11,12,13,14,15,16. Esta plataforma de chip de órgão base, denominada micro-órgão vascularizado (VMO), pode ser adaptada a praticamente qualquer sistema de órgãos para replicar a fisiologia tecidual original para modelagem de doenças, triagem de drogas e aplicações de medicina personalizada. Os VMOs são estabelecidos pela co-cultura de células endoteliais derivadas de células formadoras de colônias endoteliais (ECFC-EC), HUVEC ou iPSC-EC (doravante EC), e múltiplas células estromais na câmara, incluindo fibroblastos pulmonares humanos normais (NHLF), que remodelam a matriz, e pericitos que envolvem e estabilizam os vasos. O VMO também pode ser estabelecido como um sistema modelo de câncer pela co-cultura de células tumorais com o estroma associado para criar um modelo de microtumor vascularizado (VMT)8,9,10,11,12,13, ou chip tumoral. Através do co-cultivo de múltiplos tipos celulares em um ambiente de fluxo dinâmico, redes microvasculares perfundidas formam de novo nas câmaras teciduais do dispositivo, onde a vasculogênese é intimamente regulada por fluxos intersticiais14,15. O meio é conduzido através dos canais microfluídicos do dispositivo por uma cabeça de pressão hidrostática que fornece nutrientes exclusivamente através dos microvasos às células vizinhas da câmara tecidual, com coeficiente de permeabilidade de 1,2 x 10-7 cm/s, semelhante ao observado para capilares devivo8.
A incorporação de microvasos auto-organizadores ao modelo VMT representa um avanço significativo, pois: 1) mimetiza a estrutura e a função de massas tumorais vascularizadas in vivo; 2) pode modelar etapas-chave da metástase, incluindo interações tumor-endotélio e células estromais; 3) estabelece barreiras fisiologicamente seletivas para a liberação de nutrientes e medicamentos, melhorando a triagem farmacêutica; e 4) permite a avaliação direta de fármacos com capacidades antiangiogênica e antimetastática. Ao replicar a entrega in vivo de nutrientes, drogas e células imunes em um microambiente 3D complexo, a plataforma VMO/VMT é um modelo fisiologicamente relevante que pode ser usado para realizar o rastreamento de drogas e estudar o câncer, a biologia vascular ou órgão-específica. É importante ressaltar que a VMT suporta o crescimento de vários tipos de tumores, incluindo câncer de cólon, melanoma, câncer de mama, glioblastoma, câncer de pulmão, carcinomatose peritoneal, câncer de ovário e câncer de pâncreas8,9,10,11,12,13. Além de ser de baixo custo, facilmente estabelecida e organizada para experimentos de alto rendimento, a plataforma microfluídica é totalmente opticamente compatível para análise de imagens em tempo real de interações tumor-estroma e resposta a estímulos ou terapêutica. Cada tipo de célula no sistema é marcado com um marcador fluorescente diferente para permitir a visualização direta e o rastreamento do comportamento celular durante todo o experimento, criando uma janela para o microambiente dinâmico do tumor. Mostramos anteriormente que o VMT modela mais fielmente o crescimento, arquitetura, heterogeneidade, assinaturas de expressão gênica e respostas a drogas in vivo do que as modalidades de culturapadrão10. É importante ressaltar que o VMT apoia o crescimento e o estudo de células derivadas do paciente, incluindo células cancerosas, que modelam melhor a patologia dos tumores pais do que as culturas esferoides padrão e avançam ainda mais os esforços de medicina personalizada11. Este manuscrito descreve os métodos para estabelecer a VMT, mostrando sua utilidade para o estudo de cânceres humanos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Quase todos os tecidos do corpo recebem nutrientes e oxigênio através da vasculatura, tornando-se um componente crítico para a modelagem realista da doença e triagem de drogas in vitro. Além disso, várias neoplasias malignas e estados patológicos são definidos por disfunção e hiperpermeabilidade do endotéliovascular3. Notavelmente, no câncer, a vasculatura associada ao tumor é frequentemente mal perfundida, interrompida e vazada, agindo assim como uma barreira para a entrega …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos aos membros do laboratório do Dr. Christopher Hughes por sua valiosa contribuição nos procedimentos descritos, bem como aos nossos colaboradores no laboratório do Dr. Abraham Lee por sua assistência com o projeto e fabricação da plataforma. Este trabalho foi apoiado pelas seguintes bolsas: UG3/UH3 TR002137, R61/R33 HL154307, 1R01CA244571, 1R01 HL149748, U54 CA217378 (CCWH) e TL1 TR001415 e W81XWH2110393 (SJH).
Materials
| Fabrication | |||
| (3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane, 95% | Sigma-Aldrich | 175617-100G | |
| Greiner Bio-One μClear Bottom 96-well Polystyrene Microplates | Greiner Bio-One | 655096 | |
| Methanol ≥99.8% ACS | VWR Chemicals BDH | BDH1135-1LP | |
| MILTEX Sterile Disposable Biopsy Punch with Plunger, 1mm diameter, | Integra Miltex | 33-31AA-P/25 | |
| PDMS membrane | PAX Industries | HT-6240 | |
| Plasma Cleaner PDC-001 | Harrick Plasma | N/A | |
| Smooth-Cast 385 | Smooth-On | N/A | |
| SP Bel-Art Lab Companion Clear Polycarbonate Cabinet Style Vacuum Desiccator | Bel-Art | F42400-4031 | |
| Standard Lids with Condensation Rings, 96-well plate | VWR | 82050-827 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) | Dow | 4019862 | |
| Cell culture/Loading | |||
| BioTek Lionheart FX Automated Microscope | Agilent | CYT5MFAW | |
| CELLvo Human Endothelial Progenitor Cells | StemBioSys | N/A | |
| Collagen I, rat tail | Enzo Life Sciences | ||
| Collagenase from Clostridium histolyticum (type 4) | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Corning Hank’s Balanced Salt Solution, 1X without calcium and magnesium | Corning | 21-021-CV | |
| Corning DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Corning | 10013CV | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
| EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | |
| Fibrinogen from bovine plasma | Neta Scientific | SIAL-341573 | |
| Fibronectin human plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Fluorescein isothiocyanate–dextran (70kDa) | Sigma-Aldrich | FD70S-1G | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Hyaluronidase from sheep testes (type 4) | Sigma-Aldrich | H6254 | |
| Laminin Mouse Protein | Gibco | 23017015 | |
| Leica TCS SP8 | Leica | N/A | |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | |
| NHLF – Normal Human Lung Fibroblasts | Lonza | CC-2512 | |
| Nikon Eclipse Ti | Nikon | N/A | |
| Paraformaldehyde 4% in 0.1M Phosphate BufferSaline, pH 7.4 | Electron Microscopy Sciences | 15735-90-1L | |
| PBMCs – Peripheral blood mononuclear cells | Lonza | CC-2702 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
| Premium Grade Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Avantor Seradigm | 97068-091 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P10144 | |
| Quick-RNA Microprep Kit | Zymo Research | R1051 | |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | T4648 | |
| Triton X-100 (Electrophoresis), | Fisher BioReagents | BP151-100 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Gibco | 12605028 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300062 | |
| Vasculife | Lifeline Cell Technology | LL-0003 |
Referências
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Wagle, N. S., Jemal, A. Cancer statistics, 2023. CA Cancer J Clin. 73 (1), 17-48 (2023).
- Hachey, S. J., Hughes, C. C. W. Applications of tumor chip technology. Lab Chip. 18 (19), 2893-2912 (2018).
- Ewald, M. L., Chen, Y. H., Lee, A. P., Hughes, C. C. W. The vascular niche in next generation microphysiological systems. Lab Chip. 21 (17), 3615-3616 (2021).
- Osaki, T., Sivathanu, V., Kamm, R. D. Vascularized microfluidic organ-chips for drug screening, disease models and tissue engineering. Curr Opin Biotechnol. 52, 116-123 (2018).
- Shirure, V. S., Hughes, C. C. W., George, S. C. Engineering vascularized organoid-on-a-chip models. Annu Rev Biomed Eng. 23, 141-167 (2021).
- Del Piccolo, N., et al. Tumor-on-chip modeling of organ-specific cancer and metastasis. Adv Drug Deliv Rev. 175, 113798 (2021).
- Sontheimer-Phelps, A., Hassell, B. A., Ingber, D. E. Modelling cancer in microfluidic human organs-on-chips. Nat Rev Cancer. 19 (2), 65-81 (2019).
- Sobrino, A., et al. 3D microtumors in vitro supported by perfused vascular networks. Sci Rep. 6, 31589 (2016).
- Phan, D. T. T., et al. A vascularized and perfused organ-on-a-chip platform for large-scale drug screening applications. Lab Chip. 17 (3), 511-520 (2017).
- Hachey, S. J., et al. An in vitro vascularized micro-tumor model of human colorectal cancer recapitulates in vivo responses to standard-of-care therapy. Lab Chip. 21 (7), 1333-1351 (2021).
- Hachey, S. J., et al. A Human Vascularized Micro-Tumor Model of Patient-Derived Colorectal Cancer Recapitulates Clinical Disease. Transl Res. 255, 97-108 (2023).
- Liu, Y., et al. Human in vitro vascularized micro-organ and micro-tumor models are reproducible organ-on-a-chip platforms for studies of anticancer drugs. Toxicology. 445, 152601 (2020).
- Jahid, S., et al. Structure-based Design of CDC42 Effector Interaction Inhibitors for the Treatment of Cancer. Cell Rep. 39 (4), 110760 (2022).
- Hsu, Y. H., Moya, M. L., Hughes, C. C. W., George, S. C., Lee, A. P. A microfluidic platform for generating large-scale nearly identical human microphysiological vascularized tissue arrays. Lab Chip. 13 (15), 2990-2998 (2013).
- Moya, M. L., Hsu, Y. H., Lee, A. P., Christopher, C. W. H., George, S. C. In vitro perfused human capillary networks. Tissue Eng – Part C: Methods. 19 (9), 730-737 (2013).
- Wang, X., et al. An on-chip microfluidic pressure regulator that facilitates reproducible loading of cells and hydrogels into microphysiological system platforms. Lab Chip. 16 (5), 868-876 (2016).
- Phan, D. T., et al. Blood-brain barrier-on-a-chip: Microphysiological systems that capture the complexity of the blood-central nervous system interface. Exp Biol Med. 242 (17), 1669-1678 (2017).
- Kurokawa, Y. K., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells for three-dimensional microphysiological systems. Tissue Eng Part C: Methods. 23 (8), 474-484 (2017).
- Romero-López, M., et al. Recapitulating the human tumor microenvironment: Colon tumor-derived extracellular matrix promotes angiogenesis and tumor cell growth. Biomaterials. 116, 118-129 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: Image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), R100 (2006).
- Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. A computational tool for quantitative analysis of vascular networks. PLoS one. 6 (11), e27385 (2011).
- Corliss, B. A., et al. REAVER: A program for improved analysis of high-resolution vascular network images. Microcirculation. 27 (5), e12618 (2020).
- Urban, G., et al. Deep learning for drug discovery and cancer research: Automated analysis of vascularization images. IEEE/ACM Trans Comput Biol Bioinform. 16 (3), 1029-1035 (2019).
