Opzetten van een fysiologisch menselijk gevasculariseerd microtumormodel voor kankeronderzoek
Summary
Dit protocol presenteert een fysiologisch relevant tumor-on-a-chip-model om basis- en translationeel kankeronderzoek bij mensen met een hoge doorvoer uit te voeren, het screenen van geneesmiddelen, ziektemodellering en gepersonaliseerde geneeskundebenaderingen te bevorderen met een beschrijving van laad-, onderhouds- en evaluatieprocedures.
Abstract
Een gebrek aan gevalideerde kankermodellen die de tumormicro-omgeving van solide kankers in vitro recapituleren, blijft een belangrijk knelpunt voor preklinisch kankeronderzoek en therapeutische ontwikkeling. Om dit probleem op te lossen, hebben we de gevasculariseerde microtumor (VMT) of tumorchip ontwikkeld, een microfysiologisch systeem dat de complexe micro-omgeving van de menselijke tumor realistisch modelleert. De VMT vormt zich de novo binnen een microfluïdisch platform door co-kweek van meerdere menselijke celtypen onder dynamische, fysiologische stromingsomstandigheden. Dit weefselgemanipuleerde microtumorconstruct bevat een levend doorbloed vasculair netwerk dat de groeiende tumormassa ondersteunt, net zoals nieuw gevormde bloedvaten dat in vivo doen. Belangrijk is dat medicijnen en immuuncellen de endotheellaag moeten passeren om de tumor te bereiken, waarbij in vivo fysiologische barrières voor therapeutische toediening en werkzaamheid worden gemodelleerd. Omdat het VMT-platform optisch transparant is, kan beeldvorming met hoge resolutie van dynamische processen zoals extravasatie van immuuncellen en metastase worden bereikt met directe visualisatie van fluorescerend gelabelde cellen in het weefsel. Verder behoudt de VMT in vivo tumorheterogeniteit, genexpressiehandtekeningen en geneesmiddelresponsen. Vrijwel elk tumortype kan worden aangepast aan het platform, en primaire cellen van verse chirurgische weefsels groeien en reageren op medicamenteuze behandeling in de VMT, wat de weg vrijmaakt voor echt gepersonaliseerde geneeskunde. Hier worden de methoden geschetst om de VMT op te zetten en te gebruiken voor oncologisch onderzoek. Deze innovatieve aanpak opent nieuwe mogelijkheden voor het bestuderen van tumoren en medicijnreacties, en biedt onderzoekers een krachtig hulpmiddel om kankeronderzoek vooruit te helpen.
Introduction
Kanker blijft wereldwijd een groot gezondheidsprobleem en is de tweede belangrijkste doodsoorzaak in de Verenigde Staten. Alleen al voor het jaar 2023 verwacht het National Center for Health Statistics meer dan 1,9 miljoen nieuwe gevallen van kanker en meer dan 600,000 sterfgevallen door kanker in de VS1, wat de dringende behoefte aan effectieve behandelingsbenaderingen benadrukt. Momenteel krijgt echter slechts 5,1% van de antikankertherapieën die aan klinische onderzoeken beginnen, uiteindelijk goedkeuring van de FDA. Het falen van veelbelovende kandidaten om met succes door klinische proeven te komen, kan gedeeltelijk worden toegeschreven aan het gebruik van niet-fysiologische modelsystemen, zoals 2D- en sferoïde culturen, tijdens de preklinische ontwikkeling van geneesmiddelen. Deze klassieke kankermodellen missen essentiële componenten van de micro-omgeving van de tumor, zoals een stromale niche, geassocieerde immuuncellen en doorbloede vasculatuur, die belangrijke determinanten zijn van therapeutische resistentie en ziekteprogressie. Er is dus een nieuw modelsysteem nodig dat de menselijke in vivo tumormicro-omgeving beter nabootst om de klinische vertaling van preklinische bevindingen te verbeteren.
Het gebied van weefselmanipulatie gaat snel vooruit en biedt verbeterde methoden voor het bestuderen van ziekten bij de mens in laboratoriumomgevingen. Een belangrijke ontwikkeling is de opkomst van microfysiologische systemen (MPS), ook bekend als orgaanchips of weefselchips, dit zijn functionele, geminiaturiseerde menselijke organen die in staat zijn om gezonde of zieke aandoeningen na te bootsen 3,4,5. In deze context zijn tumorchips, driedimensionale microfluïdische in vitro menselijke tumormodellen, ontwikkeld voor oncologisch onderzoek 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Deze geavanceerde modellen bevatten biochemische en biofysische signalen binnen een dynamische tumormicro-omgeving, waardoor onderzoekers tumorgedrag en reacties op behandelingen in een meer fysiologisch relevante context kunnen bestuderen. Ondanks deze vooruitgang zijn er echter maar weinig groepen die met succes een levend, functioneel vaatstelsel hebben opgenomen, met name een die zichzelf patronen geeft als reactie op fysiologische stroom 3,4,5,6. De opname van een functioneel vasculair netwerk is cruciaal omdat het het mogelijk maakt om fysieke barrières te modelleren die van invloed zijn op de afgifte van geneesmiddelen of cellen, celhoming naar verschillende micro-omgevingen en transendotheliale migratie van tumor-, stromale en immuuncellen. Door deze functie op te nemen, kan de tumorchip de complexiteit die wordt waargenomen in de in vivo tumormicro-omgeving beter weergeven.
Om aan deze onvervulde behoefte te voldoen, hebben we een nieuw platform voor het screenen van geneesmiddelen ontwikkeld waarmee netwerken van microbloedvaten kunnen worden gevormd binnen een microfluïdisch apparaat 8,9,10,11,12,13,14,15,16. Dit basisorgaanchipplatform, het gevasculariseerde micro-orgaan (VMO) genoemd, kan worden aangepast aan vrijwel elk orgaansysteem om de oorspronkelijke weefselfysiologie na te bootsen voor ziektemodellering, medicijnscreening en gepersonaliseerde geneeskundetoepassingen. VMO’s worden tot stand gebracht door het samen kweken van endotheelkolonievormende cel-afgeleide endotheelcellen (ECFC-EC), HUVEC of iPSC-EC (hierna EC) en meerdere stromale cellen in de kamer, waaronder normale menselijke longfibroblasten (NHLF), die de matrix hermodelleren, en pericyten die de bloedvaten omhullen en stabiliseren. De VMO kan ook worden opgezet als een kankermodelsysteem door tumorcellen samen te kweken met het bijbehorende stroma om een gevasculariseerde microtumor (VMT)8,9,10,11,12,13 of tumorchipmodel te creëren. Door de co-kweek van meerdere celtypen in een dynamische stroomomgeving, vormen geperfuseerde microvasculaire netwerken de novo in de weefselkamers van het apparaat, waar de vasculogenese nauw wordt gereguleerd door interstitiële stroomsnelheden14,15. Het medium wordt door de microfluïdische kanalen van het apparaat aangedreven door een hydrostatische drukkop die de omringende cellen van de weefselkamer uitsluitend via de microvaten van voedingsstoffen voorziet, met een permeabiliteitscoëfficiënt van 1,2 x 10-7 cm/s, vergelijkbaar met wat wordt gezien voor haarvaten in vivo8.
De integratie van zelforganiserende microvaten in het VMT-model vertegenwoordigt een belangrijke doorbraak omdat het: 1) de structuur en functie van gevasculariseerde tumormassa’s in vivo nabootst; 2) kan belangrijke stappen van metastase modelleren, inclusief tumor-endotheliale en stromale celinteracties; 3) stelt fysiologisch selectieve barrières vast voor de afgifte van voedingsstoffen en geneesmiddelen, waardoor de farmaceutische screening wordt verbeterd; en 4) maakt directe beoordeling mogelijk van geneesmiddelen met anti-angiogene en anti-metastatische eigenschappen. Door de in vivo toediening van voedingsstoffen, medicijnen en immuuncellen in een complexe 3D-micro-omgeving na te bootsen, is het VMO/VMT-platform een fysiologisch relevant model dat kan worden gebruikt om geneesmiddelenscreening uit te voeren en kanker-, vasculaire of orgaanspecifieke biologie te bestuderen. Belangrijk is dat de VMT de groei van verschillende soorten tumoren ondersteunt, waaronder darmkanker, melanoom, borstkanker, glioblastoom, longkanker, peritoneale carcinomatose, eierstokkanker en alvleesklierkanker 8,9,10,11,12,13. Het microfluïdische platform is niet alleen goedkoop, gemakkelijk op te zetten en geschikt voor experimenten met een hoge doorvoer, maar is ook volledig optisch compatibel voor real-time beeldanalyse van tumor-stromale interacties en respons op stimuli of therapieën. Elk celtype in het systeem is gelabeld met een andere fluorescerende marker om directe visualisatie en tracking van celgedrag gedurende het hele experiment mogelijk te maken, waardoor een venster ontstaat op de dynamische micro-omgeving van de tumor. We hebben eerder aangetoond dat de VMT in vivo tumorgroei, architectuur, heterogeniteit, genexpressiehandtekeningen en geneesmiddelresponsen getrouwer modelleert dan standaard kweekmodaliteiten10. Belangrijk is dat de VMT de groei en studie van van patiënten afgeleide cellen, waaronder kankercellen, ondersteunt, waardoor de pathologie van de oudertumoren beter wordt gemodelleerd dan standaard sferoïde culturen en de inspanningen op het gebied van gepersonaliseerde geneeskunde verder worden bevorderd11. Dit manuscript schetst de methoden voor het opzetten van de VMT en toont het nut ervan voor het bestuderen van menselijke kankers.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bijna elk weefsel in het lichaam ontvangt voedingsstoffen en zuurstof via het vaatstelsel, waardoor het een cruciaal onderdeel is voor realistische ziektemodellering en screening van geneesmiddelen in vitro. Bovendien worden verschillende maligniteiten en ziektetoestanden gedefinieerd door vasculaire endotheliale disfunctie en hyperpermeabiliteit3. Met name bij kanker is tumor-geassocieerde vasculatuur vaak slecht doorbloed, verstoord en lek, waardoor het fungeert als een barrière voor t…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken de leden van het laboratorium van Dr. Christopher Hughes voor hun waardevolle inbreng in de beschreven procedures, evenals onze medewerkers in het laboratorium van Dr. Abraham Lee voor hun hulp bij het ontwerp en de fabricage van het platform. Dit werk werd ondersteund door de volgende subsidies: UG3/UH3 TR002137, R61/R33 HL154307, 1R01CA244571, 1R01 HL149748, U54 CA217378 (CCWH) en TL1 TR001415 en W81XWH2110393 (SJH).
Materials
| Fabrication | |||
| (3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane, 95% | Sigma-Aldrich | 175617-100G | |
| Greiner Bio-One μClear Bottom 96-well Polystyrene Microplates | Greiner Bio-One | 655096 | |
| Methanol ≥99.8% ACS | VWR Chemicals BDH | BDH1135-1LP | |
| MILTEX Sterile Disposable Biopsy Punch with Plunger, 1mm diameter, | Integra Miltex | 33-31AA-P/25 | |
| PDMS membrane | PAX Industries | HT-6240 | |
| Plasma Cleaner PDC-001 | Harrick Plasma | N/A | |
| Smooth-Cast 385 | Smooth-On | N/A | |
| SP Bel-Art Lab Companion Clear Polycarbonate Cabinet Style Vacuum Desiccator | Bel-Art | F42400-4031 | |
| Standard Lids with Condensation Rings, 96-well plate | VWR | 82050-827 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) | Dow | 4019862 | |
| Cell culture/Loading | |||
| BioTek Lionheart FX Automated Microscope | Agilent | CYT5MFAW | |
| CELLvo Human Endothelial Progenitor Cells | StemBioSys | N/A | |
| Collagen I, rat tail | Enzo Life Sciences | ||
| Collagenase from Clostridium histolyticum (type 4) | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Corning Hank’s Balanced Salt Solution, 1X without calcium and magnesium | Corning | 21-021-CV | |
| Corning DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Corning | 10013CV | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
| EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | |
| Fibrinogen from bovine plasma | Neta Scientific | SIAL-341573 | |
| Fibronectin human plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Fluorescein isothiocyanate–dextran (70kDa) | Sigma-Aldrich | FD70S-1G | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Hyaluronidase from sheep testes (type 4) | Sigma-Aldrich | H6254 | |
| Laminin Mouse Protein | Gibco | 23017015 | |
| Leica TCS SP8 | Leica | N/A | |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | |
| NHLF – Normal Human Lung Fibroblasts | Lonza | CC-2512 | |
| Nikon Eclipse Ti | Nikon | N/A | |
| Paraformaldehyde 4% in 0.1M Phosphate BufferSaline, pH 7.4 | Electron Microscopy Sciences | 15735-90-1L | |
| PBMCs – Peripheral blood mononuclear cells | Lonza | CC-2702 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
| Premium Grade Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Avantor Seradigm | 97068-091 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P10144 | |
| Quick-RNA Microprep Kit | Zymo Research | R1051 | |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | T4648 | |
| Triton X-100 (Electrophoresis), | Fisher BioReagents | BP151-100 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Gibco | 12605028 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300062 | |
| Vasculife | Lifeline Cell Technology | LL-0003 |
Referências
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Wagle, N. S., Jemal, A. Cancer statistics, 2023. CA Cancer J Clin. 73 (1), 17-48 (2023).
- Hachey, S. J., Hughes, C. C. W. Applications of tumor chip technology. Lab Chip. 18 (19), 2893-2912 (2018).
- Ewald, M. L., Chen, Y. H., Lee, A. P., Hughes, C. C. W. The vascular niche in next generation microphysiological systems. Lab Chip. 21 (17), 3615-3616 (2021).
- Osaki, T., Sivathanu, V., Kamm, R. D. Vascularized microfluidic organ-chips for drug screening, disease models and tissue engineering. Curr Opin Biotechnol. 52, 116-123 (2018).
- Shirure, V. S., Hughes, C. C. W., George, S. C. Engineering vascularized organoid-on-a-chip models. Annu Rev Biomed Eng. 23, 141-167 (2021).
- Del Piccolo, N., et al. Tumor-on-chip modeling of organ-specific cancer and metastasis. Adv Drug Deliv Rev. 175, 113798 (2021).
- Sontheimer-Phelps, A., Hassell, B. A., Ingber, D. E. Modelling cancer in microfluidic human organs-on-chips. Nat Rev Cancer. 19 (2), 65-81 (2019).
- Sobrino, A., et al. 3D microtumors in vitro supported by perfused vascular networks. Sci Rep. 6, 31589 (2016).
- Phan, D. T. T., et al. A vascularized and perfused organ-on-a-chip platform for large-scale drug screening applications. Lab Chip. 17 (3), 511-520 (2017).
- Hachey, S. J., et al. An in vitro vascularized micro-tumor model of human colorectal cancer recapitulates in vivo responses to standard-of-care therapy. Lab Chip. 21 (7), 1333-1351 (2021).
- Hachey, S. J., et al. A Human Vascularized Micro-Tumor Model of Patient-Derived Colorectal Cancer Recapitulates Clinical Disease. Transl Res. 255, 97-108 (2023).
- Liu, Y., et al. Human in vitro vascularized micro-organ and micro-tumor models are reproducible organ-on-a-chip platforms for studies of anticancer drugs. Toxicology. 445, 152601 (2020).
- Jahid, S., et al. Structure-based Design of CDC42 Effector Interaction Inhibitors for the Treatment of Cancer. Cell Rep. 39 (4), 110760 (2022).
- Hsu, Y. H., Moya, M. L., Hughes, C. C. W., George, S. C., Lee, A. P. A microfluidic platform for generating large-scale nearly identical human microphysiological vascularized tissue arrays. Lab Chip. 13 (15), 2990-2998 (2013).
- Moya, M. L., Hsu, Y. H., Lee, A. P., Christopher, C. W. H., George, S. C. In vitro perfused human capillary networks. Tissue Eng – Part C: Methods. 19 (9), 730-737 (2013).
- Wang, X., et al. An on-chip microfluidic pressure regulator that facilitates reproducible loading of cells and hydrogels into microphysiological system platforms. Lab Chip. 16 (5), 868-876 (2016).
- Phan, D. T., et al. Blood-brain barrier-on-a-chip: Microphysiological systems that capture the complexity of the blood-central nervous system interface. Exp Biol Med. 242 (17), 1669-1678 (2017).
- Kurokawa, Y. K., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells for three-dimensional microphysiological systems. Tissue Eng Part C: Methods. 23 (8), 474-484 (2017).
- Romero-López, M., et al. Recapitulating the human tumor microenvironment: Colon tumor-derived extracellular matrix promotes angiogenesis and tumor cell growth. Biomaterials. 116, 118-129 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: Image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), R100 (2006).
- Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. A computational tool for quantitative analysis of vascular networks. PLoS one. 6 (11), e27385 (2011).
- Corliss, B. A., et al. REAVER: A program for improved analysis of high-resolution vascular network images. Microcirculation. 27 (5), e12618 (2020).
- Urban, G., et al. Deep learning for drug discovery and cancer research: Automated analysis of vascularization images. IEEE/ACM Trans Comput Biol Bioinform. 16 (3), 1029-1035 (2019).
