Hipoksik koşullar altında kültürlenen plasental eksplantlardan izole edilen küçük EV’lerin (sEV’ler) (preeklampsinin bir yönünü modelleme) hamile olmayan yetişkin dişi farelerde kan-beyin bariyerini bozup bozmadığını değerlendirmek için bir protokol sunulmaktadır.
Serebral ödem, iskemik ve hemorajik inme gibi serebrovasküler komplikasyonlar, preeklampsi ile ilişkili maternal mortalitenin önde gelen nedenini oluşturur. Bu serebrovasküler komplikasyonların altında yatan mekanizmalar belirsizliğini korumaktadır. Bununla birlikte, plasental disfonksiyon ve kan-beyin bariyeri (BBB) bozulması ile bağlantılıdırlar. Bununla birlikte, bu iki uzak organ arasındaki bağlantı hala belirlenmektedir. Artan kanıtlar, plasentanın hücre dışı veziküller de dahil olmak üzere sinyal moleküllerini maternal dolaşıma saldığını göstermektedir. Hücre dışı veziküller, hem fizyolojik hem de patolojik koşullarda kritik sinyal parçacıkları olarak kabul edilen küçük hücre dışı veziküller (çapı 200 nm’den küçük sEV’ler) ile boyutlarına göre kategorize edilir. Preeklampside, maternal dolaşımda, sinyal fonksiyonu iyi anlaşılmamış olan dolaşımdaki sEV’lerin sayısında artış vardır. Preeklampside veya hipoksiye maruz kalan normal gebelik plasentalarından salınan plasental sEV’ler beyin endotel disfonksiyonuna ve BBB’nin bozulmasına neden olur. Bu protokolde, hipoksik koşullar altında kültürlenen plasental eksplantlardan izole edilen sEV’lerin (preeklampsinin bir yönünü modelleme) BBB’yi in vivo bozup bozmadığını değerlendiriyoruz.
Preeklampsiye bağlı maternal ölümlerin yaklaşık% 70’i, bozulmuş plasentasyon süreçleri, maternal sistemik endotel disfonksiyonu ve ciddi vakalarda çoklu organ yetmezliği 1,2 ile karakterize hipertansif bir gebelik sendromu, akut serebrovasküler komplikasyonlarla ilişkilidir 3,4. Anne ölümlerinin çoğu düşük ve orta gelirli ülkelerde meydana gelmektedir5. Bununla birlikte, preeklampsi ile ilişkili serebrovasküler komplikasyonların klinik ve epidemiyolojik önemine rağmen altta yatan mekanizmalar hala belirsizdir.
Öte yandan, hücre dışı veziküller (EV’ler) (çap ~ 30-400 nm), maternal-plasental etkileşim de dahil olmak üzere dokular ve organlar arasındaki hücreler arası iletişimin temel aracılarıdır6. Dış yüzeydeki proteinlere ve lipitlere ek olarak, EV’ler içinde kargo taşır (proteinler, RNA ve lipitler). EV’ler (1) eksozomlar (çap ~50-150 nm, küçük EV’ler (sEV’ler) olarak da adlandırılır), (2) orta/büyük EV’ler ve (3) boyut, biyogenez, içerik ve potansiyel sinyal fonksiyonuna göre farklılık gösteren apoptotik cisimler olarak kategorize edilebilir. EV’lerin bileşimi, kaynaklandıkları hücreler ve hastalık tipi7 tarafından belirlenir. Sinsityotrofoblasttan türetilen EV’ler, gebelikte plasenta kaynaklı dolaşımdaki küçük EV’leri (PDsEV’ler) tespit eden plasental alkalen fosfataz (PLAP)8,9 eksprese eder. Ayrıca, PLAP, PDsEVs kargosundaki değişiklikleri ve bunların preeklampsi ile normotansif gebeliklerdeki etkilerini ayırt etmeye yardımcı olur 10,11,12,13,14,15.
Plasenta, preeklampsi16 patofizyolojisinde veya bu hastalıkla ilişkili serebral komplikasyonlarda gerekli bileşen olarak kabul edilmiştir 17,18,19. Bununla birlikte, bu uzak organın beyin dolaşımında değişikliklere nasıl neden olabileceği bilinmemektedir. sEV’ler, biyoaktif bileşenleri donörden alıcı hücrelere aktarma kapasiteleri nedeniyle hücreden hücreye iletişimde çok önemli roller oynadığından 6,20,21, giderek artan sayıda çalışma, plasental sEV’leri beyin endotel hücreleri21,22,23,24 dahil olmak üzere maternal endotel disfonksiyonunun oluşumu ile ilişkilendirmiştir25,26preeklampsili kadınlarda. Bu nedenle, beyin endotel fonksiyonunun tehlikeye girmesi, preeklampsi ile ilişkili serebrovasküler komplikasyonlarda kritik bir bileşen olan kan-beyin bariyerinin (BBB) bozulmasına yol açabilir 3,27.
Bununla birlikte, preeklampsi28 olan kadınların serumuna maruz kalan sıçan serebral damarları veya preeklampsi29 olan kadınların plazmasına maruz kalan insan beyni endotel hücreleri kullanılarak yapılan klinik öncesi bulgular, dolaşımdaki faktör(ler)in BBB’nin bozulmasına neden olduğunu bildirmiştir. Yüksek seviyelerde proinflamatuar sitokinler (yani tümör nekroz faktörü)18,28 veya vasküler düzenleyiciler (yani vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF))29,30,31 veya oksidize lipoproteinler (okso-LDL)32,33 gibi oksidatif moleküller gibi preeklampsi sırasında maternal dolaşımda bulunan BBB’ye zarar verme potansiyeline sahip birkaç adaya rağmen, diğerleri arasında34, hiçbiri plasenta ve BBB arasında doğrudan bir bağlantı kurmaz. Son zamanlarda, hipoksik plasentalardan izole edilen sEV’ler, gebe olmayan dişi farelerde BBB’yi bozma kapasitesini göstermiştir25. Plasental sEV’ler, BBB’yi bozma kapasitesi ile listelenen dolaşım faktörlerinin çoğunu taşıyabileceğinden, sEV’ler yaralı plasentayı bağlamak, zararlı dolaşım faktörlerinin taşıyıcısı olmak ve preeklampside BBB’yi bozmak için uygun adaylar olarak kabul edilir.
Bu protokol, hipoksik koşullar altında kültürlenen plasental eksplantlardan izole edilen sEV’lerin, preeklampsi sırasında serebral komplikasyonların patofizyolojisini anlamak için bir vekil olarak gebe olmayan dişi farelerde BBB’yi bozup bozamayacağını araştırmamızı sağlar.
Bu çalışma, hipoksik koşullarda kültürlenen plasental eksplantlardan izole edilen sEV’lerin kemirgen kan-beyin bariyerinin bozulması üzerine ortaya çıkan potansiyel zararlara ilişkin yeni bilgiler ortaya koymaktadır. Patolojik mekanizma, arka beyin bölgesinde CLND-5’te bir azalmayı içerir25.
Önceki araştırmalar, preeklampsili bireylerden alınan plazma-sEV’lerin in vitro modeller kullanılarak çeşitli organlarda endotel disfonksiyonuna neden…
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar, değerli katkıları için GRIVAS Health’e ait araştırmacılara teşekkür eder. Ayrıca, Kadın Hastalıkları ve Doğum Servisi’nden ebeler ve klinik personel, Şili’deki Hospital de Chillan’a aittir. Fondecyt Regular 1200250 tarafından kuruldu.
Adult mice brain slecer matrice 3D printed | Open access file | Adult mice | Adult mice brain slicer. Printed in PLA filament. |
Anti β-Actin primary antibody | Sigma-Aldrich | Clon AC-74 | Antibody for loading control (Western blot) |
Anti-Claudin5 primary antibody | Santa cruz Biotechnology | sc-374221 | Primary antibody for tight junction protein CLDN5 of mice BBB (Western blot) |
BCA protein kit | Thermo Scientific | 23225 | Kit for measuring protein concentration |
Culture media #200 500 mL | Thermo Fisher Scientific | m200500 | Culture media for placental explants |
D180 CO2 incubator | RWD Life science | D180 | Standard incubator to estabilize explants and culture sEVs-Nor |
Evans blue dye > 75% 10 g | Sigma-Aldrich | E2129.10G | Dye to analize blood brain barrier disruption IN VIVO |
Fetal bovine serum 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | Additive growth factor for culture media 200 |
Himac Ultracentrifuge CP100NX | Himac eppendorf group | 5720410101 | Ultracentrifuge for condicioned media > 1,20,000 x g |
ImageJ software | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
Isoflurane x 100 mL | USP Baxter | 212-094 | Volatile inhalated anaesthesia agent for mice |
Kit CellTiter 96 Non-radioactive | Promega | 0000105232 | In vitro assay for placental explants viability |
Mouse IgG Secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | MO 63103 | Secondary antibody for CLDN5 (western blot) |
NanoSight NS300 | Malvern Panalytical | 90278090 | Nanotracking analysis of particles from placental explants condicioned media |
Paraformaldehide E 97% solution 500 mL | Thermo Fisher Scientific | A11313.22 | Fixative solution for brain tissue slices and intracardial perfusion (once diluted) |
PBS 1 X pH 7.4 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Wash solution for placenta explants |
Peniciline-streptomicine 100x 20 mL | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | Antiobiotics for placental explants culture media |
ProOX C21 Cytocentric O2 and CO2 Subchamber Controller | BioSpherix | SCR_021131 | CO2 regulator to induce Hypoxia in sealed chamber for sEVs-Hyp |
Sodium Thiopental 1 g | Chemie | 7061 | humanitarian euthanasia agent |
Somnosuite low flow anesthesia system | Kent Scientifics | SS-01 | Isoflurane vaporizer for small rodents |
Surgical Warming platform | Kent Scientifics | A41166 | Warming platform for mainteinance anesthesia in mice |
Syringe Filters, Polytetrafluoroethylene (PTFE), Hydrophobic, 0.22 µm, Sterile, 25 mm | Southern labware | 10026 | Filtration of condicioned media harvested from placental explants |
Tabletop High-Speed Micro Centrifuges HITACHI himac CT15E/CT15RE | Hitachi medical systems | 6020 | Serial centrifugations of condicioned media < 1,20, 000 x g |
Trinocular stereomicroscope transmided and reflective light 10x-160x | Center Medical | 2597 | Stereomicroscope to register brain slices |