JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicina

הפרעה במחסום הדם-מוח של העכבר על ידי בועיות חוץ-תאיות קטנות משליה אנושית היפוקסית

Published: January 26, 2024
doi:
10.3791/65867
, , , , , , , , ,
1Vascular Physiology Laboratory, Department of Basic Sciences,Universidad del Bío-Bío, Chillan, 2Nursery School, Health Faculty,Universidad Santo Tomás, Los Angeles, 3Obstetrics and Gynecology Department,Herminda Martin Clinical Hospital, Chillan, 4Faculty of Medicine,Universidad Católica de la Santísima Concepción, Concepcion, 5Laboratory of Animal Biotechnology, Department of Animal Science, Faculty of Veterinary Sciences,Universidad de Concepción, Chillan, 6Group of Research and Innovation in Vascular Health (GRIVAS Health), Chillan

Summary

פרוטוקול מוצג כדי להעריך אם EVs קטנים (sEVs) שבודדו מצמחי שליה שגודלו בתרבית בתנאים היפוקסיים (מודל היבט אחד של רעלת הריון) משבשים את מחסום הדם-מוח אצל עכברות בוגרות שאינן הרות.

Abstract

סיבוכים מוחיים, כולל בצקת מוחית ושבץ איסכמי ודימומי, מהווים את הגורם המוביל לתמותה אימהית הקשורה לרעלת הריון. המנגנונים הבסיסיים של סיבוכים מוחיים אלה עדיין אינם ברורים. עם זאת, הם קשורים לתפקוד לקוי של השליה ולהפרעה במחסום הדם-מוח (BBB). עם זאת, הקשר בין שני איברים מרוחקים אלה עדיין מתברר. עדויות הולכות וגדלות מצביעות על כך שהשליה משחררת מולקולות איתות, כולל שלפוחיות חוץ-תאיות, למחזור הדם של האם. שלפוחיות חוץ-תאיות מסווגות לפי גודלן, כאשר שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות (sEV בקוטר קטן מ-200 ננומטר) נחשבות לחלקיקי איתות קריטיים הן בתנאים פיזיולוגיים והן בתנאים פתולוגיים. ברעלת הריון, יש מספר מוגבר של sEV במחזור הדם האימהי, שפונקציית האיתות שלו אינה מובנת היטב. שליות שליה המשתחררות ברעלת הריון או שליות הריון רגילות החשופות להיפוקסיה גורמות לתפקוד לקוי של אנדותל המוח ולהפרעה ב- BBB. בפרוטוקול זה, אנו מעריכים אם sEVs שבודדו מצמחי שליה בתרבית בתנאים היפוקסיים (מודלים של היבט אחד של רעלת הריון) משבשים את BBB in vivo.

Introduction

כ-70% ממקרי המוות של אימהות עקב רעלת הריון, תסמונת הריון עם יתר לחץ דם המאופיינת בתהליכי שליה לקויים, תפקוד לקוי של האנדותל המערכתי של האם, ובמקרים חמורים כשל רב-מערכתי 1,2, קשורים לסיבוכים חריפים של כלי דם במוח 3,4. רוב מקרי המוות של אמהות מתרחשים במדינות בעלות הכנסה נמוכה ובינונית5. עם זאת, המנגנונים הבסיסיים עדיין אינם ברורים למרות הרלוונטיות הקלינית והאפידמיולוגית של סיבוכים מוחיים הקשורים לרעלת הריון.

מצד שני, שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) (קוטר ~ 30-400 ננומטר) הן מתווכות חיוניות של תקשורת בין-תאית בין רקמות ואיברים, כולל אינטראקציה אימהית-שליה6. בנוסף לחלבונים ושומנים על פני השטח החיצוניים, כלי רכב חשמליים נושאים מטען פנימי (חלבונים, רנ”א ושומנים). ניתן לסווג כלי רכב חשמליים ל-(1) אקסוזומים (קוטר ~50-150 ננומטר, המכונים גם כלי רכב חשמליים קטנים (sEVs)), (2) רכבים חשמליים בינוניים/גדולים, ו-(3) גופים אפופטוטיים, הנבדלים זה מזה בגודל, בביוגנזה, בתוכן ובפונקציית האיתות הפוטנציאלית. הרכב כלי הרכב החשמליים נקבע על פי התאים שמהם הם מגיעים וסוג המחלה7. EVs שמקורם ב-Syncytiotrophoblast מבטאים phosphatase אלקליין שליה (PLAP)8,9, אשר מזהה EVs קטנים שמקורם בשליה (PDsEVs) בהריון. כמו כן, PLAP מסייע להבחין בשינויים במטען PDsEVs והשפעתם ברעלת הריון לעומת הריונות נורמוטנסיים 10,11,12,13,14,15.

השליה הוכרה כמרכיב הכרחי בפתופיזיולוגיה של רעלת הריון16 או סיבוכים מוחיים הקשורים למחלה זו 17,18,19. אולם לא ידוע כיצד איבר מרוחק זה עשוי לגרום לשינויים במחזור המוח. מאחר שכלי רכב חשמליים ממלאים תפקידים מרכזיים בתקשורת בין תאים בשל יכולתם להעביר רכיבים ביו-אקטיביים מתאים מתורם לתאמקבל 6,20,21, מספר גדל והולך של מחקרים קשרו sEV שליה עם יצירת תפקוד לקוי של אנדותל אימהי 21,22,23,24, כולל תאי אנדותל במוח 25,26אצל נשים עם רעלת הריון. לפיכך, הפגיעה בתפקוד האנדותל במוח עלולה להוביל להפרעה במחסום הדם-מוח (BBB), מרכיב קריטי בסיבוכים מוחיים הקשורים לרעלת הריון 3,27.

עם זאת, ממצאים פרה-קליניים שהשתמשו בכלי דם מוחיים של חולדות שנחשפו לסרום של נשים עם רעלת הריון28 או תאי אנדותל במוח אנושי שנחשפו לפלזמה של נשים עם רעלת הריון29 דיווחו כי גורמים במחזור הדם גורמים להפרעה ב- BBB. למרות מספר מועמדים בעלי פוטנציאל לפגוע ב- BBB הקיים במחזור הדם האימהי במהלך רעלת הריון, כגון רמות גבוהות של ציטוקינים מעודדי דלקת (כלומר, גורם נמק גידולי)18,28 או מווסתי כלי דם (כלומר, גורם גדילה אנדותל כלי דם (VEGF))29,30,31, או מולקולות חמצון כגון ליפופרוטאינים מחומצנים (oxo-LDL)32,33, בין היתר34אף אחד מהם לא יוצר קשר ישיר בין השליה לבין BBB., לאחרונה, sEV שבודדו משליות היפוקסיביות הראו את היכולת לשבש את BBB בעכברות לא הרות25. מכיוון שכלי שליה חשמליים עשויים לשאת את רוב הגורמים המחזוריים המפורטים עם היכולת לשבש את BBB, sEV נחשבים מועמדים מתאימים לחבר את השליה הפגועה, להיות נשא של גורמים מזיקים במחזור הדם, ולשבש את BBB ברעלת הריון.

פרוטוקול זה מאפשר לנו לחקור אם sEV שבודדו מצמחי שליה שגודלו בתרבית בתנאים היפוקסיים יכולים לשבש את מחסום הדם-מוח בעכברות שאינן הרות כפרוקסי להבנת הפתופיזיולוגיה של סיבוכים מוחיים במהלך רעלת הריון.

Protocol

המחקר בוצע בהתאם לעקרונות שבאו לידי ביטוי בהצהרת הלסינקי ובאישור ועדות הביקורת האתית המתאימות. כל המשתתפים האנושיים נתנו את הסכמתם מדעת לפני איסוף הדגימה, כפי שדווח קודם לכן25. בנוסף, ועדת הביואתיקה והבטיחות הביולוגית של אוניברסיטת Bío-Bío אישרה פרויקט זה (מענק Fondecyt 1200250). העבוד?…

Representative Results

פרוטוקול זה מעריך את היכולת של sEVs שמקורם בשליות שגודלו בתרבית בהיפוקסיה לשבש את BBB בעכברות שאינן הרות. שיטה זו מאפשרת להבין טוב יותר את הקשר הפוטנציאלי בין השליה למוח בתנאים נורמליים ופתולוגיים. בפרט, שיטה זו עשויה להוות פרוקסי לניתוח השתתפות sEV שליה בהופעת סיבוכים מוחיים ברעלת הריון. <p c…

Discussion

מחקר זה חושף תובנות חדשות לגבי נזק פוטנציאלי הנובע מ-sEV שבודדו מצמחי שליה שגודלו בתרבית בתנאים היפוקסיים על שיבוש מחסום הדם-מוח של מכרסמים. המנגנון הפתולוגי כולל הפחתה ב- CLND-5 באזור המוח האחורי25.

מחקרים קודמים גילו כי פלסמה-sEV מאנשים עם רעלת הריון גורמים לתפקוד ל?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים רוצים להודות לחוקרים השייכים ל-GRIVAS Health על תרומתם רבת הערך. כמו כן, מיילדות וצוות קליני משירות המיילדות והגינקולוגיה שייכים לבית החולים דה צ’ילאן, צ’ילה. נוסדה על ידי Fondecyt Regular 1200250.

Materials

Adult mice brain slecer matrice 3D printed Open access file Adult mice Adult mice brain slicer. Printed in PLA filament.
Anti β-Actin primary antibody Sigma-Aldrich Clon AC-74 Antibody for loading control (Western blot)
Anti-Claudin5 primary antibody Santa cruz Biotechnology sc-374221 Primary antibody for tight junction protein CLDN5 of mice BBB (Western blot)
BCA protein kit Thermo Scientific 23225 Kit for measuring protein concentration
Culture media #200 500 mL Thermo Fisher Scientific m200500 Culture media for placental explants
D180 CO2 incubator RWD Life science D180 Standard incubator to estabilize explants and culture sEVs-Nor
Evans blue dye  > 75% 10 g Sigma-Aldrich E2129.10G Dye to analize blood brain barrier disruption IN VIVO
Fetal bovine serum 500 mL Thermo Fisher Scientific 16000044 Additive growth factor for culture media 200
Himac Ultracentrifuge CP100NX Himac eppendorf group 5720410101 Ultracentrifuge for condicioned media > 1,20,000 x g
ImageJ software NIH https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Isoflurane x 100 mL USP Baxter 212-094 Volatile inhalated anaesthesia agent for mice
Kit CellTiter 96 Non-radioactive  Promega 0000105232 In vitro assay for placental explants viability
Mouse IgG Secondary antibody Thermo Fisher Scientific MO 63103 Secondary antibody for CLDN5 (western blot)
NanoSight NS300 Malvern Panalytical 90278090 Nanotracking analysis of particles from placental explants condicioned media
Paraformaldehide E 97% solution 500 mL Thermo Fisher Scientific A11313.22 Fixative solution for brain tissue slices and intracardial perfusion (once diluted)
PBS 1 X pH 7.4 500 mL Thermo Fisher Scientific 10010023 Wash solution for placenta explants
Peniciline-streptomicine 100x 20 mL Thermo Fisher Scientific 10378016 Antiobiotics for placental explants culture media
ProOX C21 Cytocentric O2 and CO2 Subchamber Controller BioSpherix SCR_021131 CO2 regulator to induce Hypoxia in sealed chamber for sEVs-Hyp
Sodium Thiopental 1 g Chemie 7061 humanitarian euthanasia agent
Somnosuite low flow anesthesia system Kent Scientifics SS-01 Isoflurane vaporizer for small rodents
Surgical Warming platform Kent Scientifics A41166 Warming platform for mainteinance anesthesia in mice
Syringe Filters, Polytetrafluoroethylene (PTFE), Hydrophobic, 0.22 µm, Sterile, 25 mm Southern labware 10026 Filtration of condicioned media harvested from placental explants 
Tabletop High-Speed Micro Centrifuges HITACHI himac CT15E/CT15RE Hitachi medical systems 6020 Serial centrifugations of condicioned media < 1,20, 000 x g
Trinocular stereomicroscope transmided and reflective light 10x-160x  Center Medical 2597 Stereomicroscope to register brain slices
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Lisonkova, S., Joseph, K. S. Incidence of preeclampsia: risk factors and outcomes associated with early- versus late-onset disease. Am J Obstet Gynecol. 209 (544), 544.e1-544.e12 (2013).
  2. Sibai, B., Dekker, G., Kupferminc, M. Preeclampsia. Lancet. 365 (9461), 785-799 (2005).
  3. Hammer, E. S., Cipolla, M. J. Cerebrovascular dysfunction in preeclamptic pregnancies. Curr Hypertens Rep. 17 (8), 64 (2015).
  4. Okanloma, K. A., Moodley, J. Neurological complications associated with the preeclampsia/eclampsia syndrome. Int J Gynaecol Obstet. 71, 223-225 (2000).
  5. Frias, A. E., Belfort, M. A. Post magpie: how should we be managing severe preeclampsia. Curr Opin Gynecol Obstet. 15 (6), 489-495 (2003).
  6. Familari, M., Cronqvist, T., Masoumi, Z., Hansson, S. R. Placenta-derived extracellular vesicles: Their cargo and possible functions. Reprod Fertil Dev. 29 (3), 433-447 (2017).
  7. Montoro-Garcia, S., Shantsila, E., Marin, F., Blann, A., Lip, G. Y. Circulating microparticles: new insights into the biochemical basis of microparticle release and activity. Basic Res Cardiol. 106, 911-923 (2011).
  8. Germain, S. J., Sacks, G. P., Sooranna, S. R., Sargent, I. L., Redman, C. W. Systemic inflammatory priming in normal pregnancy and preeclampsia: the role of circulating syncytiotrophoblast microparticles. J Immunol. 178 (9), 5949-5956 (2007).
  9. Tannetta, D., Masliukaite, I., Vatish, M., Redman, C., Sargent, I. Update of syncytiotrophoblast derived extracellular vesicles in normal pregnancy and preeclampsia. J Reprod Immunol. 119, 98-106 (2017).
  10. Collett, G. P., Redman, C. W., Sargent, I. L., Vatish, M. Endoplasmic reticulum stress stimulates the release of extracellular vesicles carrying danger-associated molecular pattern (DAMP) molecules. Oncotarget. 9 (6), 6707-6717 (2018).
  11. Cooke, W. R., et al. Maternal circulating syncytiotrophoblast-derived extracellular vesicles contain biologically active 5′-tRNA halves. Biochem Biophys Res Commun. 518 (1), 107-113 (2019).
  12. Gill, M., et al. Placental syncytiotrophoblast-derived extracellular vesicles carry active nep (neprilysin) and are increased in preeclampsia. Hypertension. 73 (5), 1112-1119 (2019).
  13. Kandzija, N., et al. Placental extracellular vesicles express active dipeptidyl peptidase IV; levels are increased in gestational diabetes mellitus. J Extracell Vesicles. 8 (1), 1617000 (2019).
  14. Motta-Mejia, C., et al. Placental vesicles carry active endothelial nitric oxide synthase and their activity is reduced in preeclampsia. Hypertension. 70 (2), 372-381 (2017).
  15. Sammar, M., et al. Reduced placental protein 13 (PP13) in placental derived syncytiotrophoblast extracellular vesicles in preeclampsia – A novel tool to study the impaired cargo transmission of the placenta to the maternal organs. Placenta. 66, 17-25 (2018).
  16. Burton, G. J., Woods, A. W., Jauniaux, E., Kingdom, J. C. Rheological and physiological consequences of conversion of the maternal spiral arteries for uteroplacental blood flow during human pregnancy. Placenta. 30 (6), 473-482 (2009).
  17. Warrington, J. P., et al. Placental ischemia in pregnant rats impairs cerebral blood flow autoregulation and increases blood-brain barrier permeability. Physiological Reports. 2 (8), e12134-e12134 (2014).
  18. Warrington, J. P., Drummond, H. A., Granger, J. P., Ryan, M. J. Placental Ischemia-induced increases in brain water content and cerebrovascular permeability: Role of TNFα. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 309 (11), R1425-R1431 (2015).
  19. Johnson, A. C., et al. Magnesium sulfate treatment reverses seizure susceptibility and decreases neuroinflammation in a rat model of severe preeclampsia. PLoS ONE. 9 (11), e113670 (2014).
  20. Escudero, C. A., et al. Role of extracellular vesicles and microRNAs on dysfunctional angiogenesis during preeclamptic pregnancies. Front Physiol. 7, 1-17 (2016).
  21. Salomon, C., et al. Placental exosomes as early biomarker of preeclampsia: Potential role of exosomalmicrornas across gestation. J Clin Endocrinol Metab. 102 (9), 3182-3194 (2017).
  22. Knight, M., Redman, C. W., Linton, E. A., Sargent, I. L. Shedding of syncytiotrophoblast microvilli into the maternal circulation in pre-eclamptic pregnancies. Br J Obstet Gynaecol. 105 (6), 632-640 (1998).
  23. Gilani, S. I., Weissgerber, T. L., Garovic, V. D., Jayachandran, M. Preeclampsia and extracellular vesicles. Curr Hypertens Rep. 18 (9), 68 (2016).
  24. Dutta, S., et al. Hypoxia-induced small extracellular vesicle proteins regulate proinflammatory cytokines and systemic blood pressure in pregnant rats. Clin Sci (Lond). 134 (6), 593-607 (2020).
  25. Leon, J., et al. Disruption of the blood-brain barrier by extracellular vesicles from preeclampsia plasma and hypoxic placentae: attenuation by magnesium sulfate. Hypertension. 78 (5), 1423-1433 (2021).
  26. Han, C., et al. Placenta-derived extracellular vesicles induce preeclampsia in mouse models. Haematologica. 105 (6), 1686-1694 (2020).
  27. Amburgey, O. A., Chapman, A. C., May, V., Bernstein, I. M., Cipolla, M. J. Plasma from preeclamptic women increases blood-brain barrier permeability: role of vascular endothelial growth factor signaling. Hypertension. 56 (5), 1003-1008 (2010).
  28. Cipolla, M. J., et al. Pregnant serum induces neuroinflammation and seizure activity via TNFalpha. Exp Neurol. 234 (2), 398-404 (2012).
  29. Bergman, L., et al. Preeclampsia and increased permeability over the blood brain barrier – a role of vascular endothelial growth receptor 2. Am J Hypertens. 34 (1), 73-81 (2021).
  30. Torres-Vergara, P., et al. Dysregulation of vascular endothelial growth factor receptor 2 phosphorylation is associated with disruption of the blood-brain barrier and brain endothelial cell apoptosis induced by plasma from women with preeclampsia. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1868 (9), 166451 (2022).
  31. Schreurs, M. P., Houston, E. M., May, V., Cipolla, M. J. The adaptation of the blood-brain barrier to vascular endothelial growth factor and placental growth factor during pregnancy. FASEB J. 26 (1), 355-362 (2012).
  32. Schreurs, M. P., Cipolla, M. J. Cerebrovascular dysfunction and blood-brain barrier permeability induced by oxidized LDL are prevented by apocynin and magnesium sulfate in female rats. J Cardiovasc Pharmacol. 63 (1), 33-39 (2014).
  33. Schreurs, M. P. H., et al. Increased oxidized low-density lipoprotein causes blood-brain barrier disruption in early-onset preeclampsia through LOX-1. FASEB J. 27 (3), 1254-1263 (2013).
  34. Escudero, C., et al. Brain vascular dysfunction in mothers and their children exposed to preeclampsia. Hypertension. 80 (2), 242-256 (2023).
  35. Russell, W. M. S., Burch, R. L. The principles of humane experimental technique. Universities Federation of Animal Welfare. , (1959).
  36. Miller, R. K., et al. Human placental explants in culture: approaches and assessments. Placenta. 26 (6), 439-448 (2005).
  37. Troncoso, F. A. J., Herlitz, K., Ruiz, F., Bertoglia, P., Escudero, C. Elevated pro-angiogenic phenotype in feto-placental tissue from gestational diabetes mellitus. Placenta. 36 (4), 2 (2015).
  38. Zhang, H. C., et al. Microvesicles derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells stimulated by hypoxia promote angiogenesis both in vitro and in vivo. Stem Cells Dev. 21 (18), 3289-3297 (2012).
  39. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 3 (Unit 3), 22 (2006).
  40. Carroll, R. W., et al. A rapid murine coma and behavior scale for quantitative assessment of murine cerebral malaria. PLoS One. 5 (10), e13124 (2010).
  41. Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio Protoc. 11 (5), e3988 (2021).
  42. Walchli, T., et al. Quantitative assessment of angiogenesis, perfused blood vessels and endothelial tip cells in the postnatal mouse brain. Nat Protoc. 10 (1), 53-74 (2015).
  43. Wang, H. L., Lai, T. W. Optimization of Evans blue quantitation in limited rat tissue samples. Sci Rep. 4, 6588 (2014).
  44. Morita, K., Sasaki, H., Furuse, M., Tsukita, S. Endothelial claudin: claudin-5/TMVCF constitutes tight junction strands in endothelial cells. J Cell Biol. 147 (1), 185-194 (1999).
  45. Lara, E., et al. Abnormal cerebral microvascular perfusion and reactivity in female offspring of reduced uterine perfusion pressure (RUPP) mice model. J Cereb Blood Flow Metab. 42 (12), 2318-2332 (2022).
  46. Chang, X., et al. Exosomes from women with preeclampsia induced vascular dysfunction by delivering sflt (soluble fms-like tyrosine kinase)-1 and seng (soluble endoglin) to endothelial cells. Hypertension. 72, 1381-1390 (2018).
  47. Smarason, A. K., Sargent, I. L., Starkey, P. M., Redman, C. W. The effect of placental syncytiotrophoblast microvillous membranes from normal and pre-eclamptic women on the growth of endothelial cells in vitro. BJOG. 100 (10), 943-949 (1993).

Tags

Extracellular VesiclesBlood-brain BarrierPlacentaPreeclampsiaHypoxiaCerebrovascular ComplicationsMaternal MortalityBrain Endothelial Dysfunction
check_url/pt/65867?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Sandoval, H., León, J., Troncoso, F., de la Hoz, V., Cisterna, A., Contreras, M., Castro, F. O., Ibañez, B., Acurio, J., Escudero, C. Disruption of the Mouse Blood-Brain Barrier by Small Extracellular Vesicles from Hypoxic Human Placentas. J. Vis. Exp. (203), e65867, doi:10.3791/65867 (2024).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image