여기에서는 초파리 멜라노가스터 에 약물 및 식물 추출물을 먹이고 초파리의 분변 침전물을 분석하여 위장관에 미치는 영향을 평가하는 방법을 설명합니다. 약물 처리된 파리는 추가 연구를 위한 모델로 사용될 수 있습니다.
인간의 위장 생리학을 연구하기 위해 생물 의학 과학자들은 모델 유기체의 사용에 의존해 왔습니다. 많은 연구자들이 장 기능을 연구하기 위해 생쥐를 모델로 사용했지만, 초파리 멜라노가스터(D. melanogaster)에 초점을 맞춘 보고서는 소수에 불과합니다. 쥐에 비해 초파리는 수명주기가 짧고 유지 보수가 비용 효율적이고 간단하며 윤리적 문제가 없다는 등 많은 장점이 있습니다. 또한 포유류의 위장 생리학, 해부학 및 신호 전달 경로는 D. melanogaster에서 매우 잘 보존되어 있습니다. 식물 추출물은 전통적으로 설사와 변비를 치료하는 데 사용되어 왔습니다. 예를 들어, 프시디움 구아자바 (P. guajava)는 열대 지방에서 가장 잘 알려진 지사제 중 하나입니다. 그러나 D. melanogaster에서 지사제와 완하제 및 식물 추출물의 효과를 평가한 연구는 없었으며, 포유류에 비해 초파리에서 유사한 효과(예: 지사제의 경우 더 작고, 더 농축되고, 덜 풍부한 대변 침전물)가 발생할 수 있는지는 아직 알려지지 않았습니다. 이 연구에서는 P. guajava 에 의해 유도된 지사제 효과가 설사 표현형을 나타내는 D. melanogaster 균주에서 입증되었습니다. 파리에 의해 생성된 분변 샘플링은 염료가 보충된 식품을 사용하여 모니터링됩니다. 이 프로토콜은 약물로 음식을 준비하고, 이러한 음식 준비에 먹인 파리의 배설물 침전물을 평가하고, 얻은 데이터를 해석하는 데 사용되는 방법을 간략하게 설명합니다.
소화관이라고도 하는 위장관(GI)은 영양소의 소화 및 흡수와 소화되지 않은 제품의 배설을 담당합니다1. 위장관은 불편함, 통증 및 일상 생활에 지장을 줄 수 있는 다양한 장애에 취약합니다. 위장 장애에는 복통과 불편감, 복부 팽만감, 속 쓰림, 소화 불량 또는 소화 불량, 메스꺼움, 구토, 설사, 변비등이 있습니다 2. 설사는 위장장애(GI disorder)3의 가장 흔한 증상이며, 24시간 동안 적어도 3회 이상 묽은 변을 보는 질환으로 정의된다4. 설사는 박테리아, 바이러스, 기생충, 곰팡이 등 다양한 병원균에 의해 발생하며, 약물에 의해서도 발생할 수 있다 5,6. 전 세계적으로 설사는 5세 미만 아동 사망의 두 번째 주요 원인이다7. 설사는 저절로 해결될 수 있지만, 설사가 며칠 이상 지속되면 더 심각한 기저 질환을 나타낼 수도 있습니다.
장관을 연구하기 위해 연구자들은 생쥐, 쥐, 돼지와 같은 동물 모델을 사용합니다 8,9. 그러나 이러한 동물을 사용하는 것은 전문 시설과 윤리적 고려 사항이 필요하기 때문에 비용과 시간이 많이 소요될 수 있습니다. 최근 연구에 따르면 D. melanogaster는 위장관을 연구하고 재생 항상성 유지, 면역 노화의 발달, 상피 장벽 기능의 상실 및 대사 항상성 감소와 같은 일부 메커니즘을 조사하는 모델로 사용될 수 있습니다10,11. 초파리로 알려진 D. melanogaster는 인간과 높은 수준의 유전적 상동성을 공유합니다. 인간 질병 유전자의 약 75%는 Fly12에서 기능적 상동체를 가지고 있는 것으로 여겨집니다. 그들은 또한 앞창자, 중창자, 뒷창자로 구성된 간단한 소화 시스템을 가지고 있다13. D. melanogaster는 실험실에서 배양하기 쉽고 다양한 방법으로 유전자 변형이 가능합니다14. 그러므로, 생체 내 테스트를 위해 D. melanogaster를 사용하는 것은 연구원이 통제된 환경에서 복잡한 생물학적 과정을 연구할 수 있도록 하는 강력한 도구입니다.
세계보건기구(WHO)에 따르면, 개발도상국에 거주하는 사람들의 약 80%가15년 동안 전통 의학을 이용하고 있습니다. 약용 식물의 높은 사용은 쉽게 구할 수 있고, 저렴하며, 부작용이 거의 없다는 사실로 설명할 수 있다16. 허브 요법에 사용되는 주요 식물 부위는 잎, 껍질, 뿌리, 씨앗17 이며, 주요 준비 방법은 주입, 달인 및 침용18입니다. 이러한 약초 요법에는 알칼로이드, 테르페노이드, 플라보노이드, 스테로이드, 탄닌 및 탄수화물19과 같은 식물 화학 물질이 포함되어 있어 인체에 치료 효과가 있습니다. 사람들은 설사, 복통, 이질과 같은 위장 장애를 치료하기 위해 다양한 약용 식물을 사용합니다20. 예를 들어, 프시디움 구아바는 세계에서 설사를 치료하는 데 가장 일반적으로 사용되는 식물 중 하나이다. 다양한 약리학 및 임상 테스트에서 이미 안전성이 입증되어21,22를 연구하기에 좋은 지사제 후보가 되었습니다. 그러나 한약의 가장 큰 한계는 효율성과 안전성 평가가 부족하고 사용되는 식물 추출물의 성분에 대한 명확하고 완전한 정보가 부족하다는 점이다23. 생약의 효율성과 안전성을 검증하기 위해서는 실험 및 임상 검증을 포함하는 체계적인 접근이 필요하며, 이러한 접근법은 in vivo 및 in vitro 연구에서 얻은 충분한 데이터로 뒷받침되어야 합니다.
설사 치료에 대한 효능에 대한 전통적인 치료법을 평가하기 위해 최근 수십 년 동안 쥐와 쥐의 사용이 우세했습니다24,25. 파리와 포유류 사이의 사용 용이성, 저렴함, 복제 가능, 보존된 흡수 및 소화 기능, 앞서 언급한 주요 이점으로 인해 D. melanogaster를 식물의 지사제 활성을 평가하는 모델로 사용할 것을 제안합니다. D. melanogaster의 설사 표현형은 분변 침전물의 증가, 더 큰 침전물 크기, 더 밝은 착색(덜 농축됨) 및 더 높은 분변 물질을 포함한 몇 가지 특징으로 특징지어질 수 있다26. 이 표현형은 분변 침전물 수, 총 침전물 면적, 평균 밝기 및 총 통합 광학 밀도(IOD)와 같은 다양한 매개변수를 사용하여 정량화할 수 있습니다. 총 IOD는 침전물의 총 염료 함량으로 정의되며, 이는 배설된 총 배설물27을 의미합니다. 이전에, 분석법은 D. melanogaster27,28의 대변 침전물을 분석하기 위하여 개발되었다. 이 분석에서는 배설물의 최종 판독기(T.U.R.D.)를 배설물 분석 도구로 사용하여 배설물 침전물의 수, 크기 및 밝기를 확인하여 초파리의 장 생리를 모니터링할 수 있습니다. 그러나 이 방법은 파리의 설사 표현형을 평가하는 데 적용되지 않았습니다. 이온 수송 펩타이드(ITP) 유전자는 갈증과 배설의 중요한 내분비 조절자이며 D. melanogaster의 섭식과 수분 항상성을 결합합니다. 최근 연구에서 위장관을 통한 음식물 이동 속도와 배변 사건의 빈도는 ITP 과발현에 의해 감소하고 ITP 녹다운에 의해 증가하는 것으로 나타났습니다. 후자의 표현형은 이 연구의 저자들에 의해 설사로 기술되었다29.
이 프로토콜에서는 ITPi 균주를 설사 모델로 사용하여 D. melanogaster의 위장관에 대한 지사제(즉, 구아바 잎 추출물)의 효과를 평가하기 위해 분변 침전물 분석의 수정된 버전을 사용합니다. 이 방법의 전반적인 목표는 1) 약물 및 식물 추출물의 지사제 효과를 평가하기 위한 쉽고 신뢰할 수 있는 방법을 제공하고 2) 생리활성 유도 접근법을 적용하여 식물 추출물에서 지사제 효과를 담당하는 생리 활성 화합물을 발견할 수 있도록 하는 것입니다.
D. melanogaster 는 D. melanogaster 와 인간 사이 유전자에 있는 유사성 때문에 각종 생물학 과정을 위한 모형으로 넓게 받아들여졌다36. D . melanogaster 를 장관을 연구하기 위한 모델로 사용하는 것이 일반적이며 T.U.R.D.의 적용은 대변 침전물의 수, 면적 및 양을 추정하는 데 사용되었습니다. 그러나 표현형 검출 방법은 초파리의 설사를 평가하는 데 사용되지 않았습니다. 따라서 이 프로토콜은 대변 침전물을 감지하여 설사의 존재를 대략적으로 평가하는 새로운 방법을 도입합니다.
대변 침전물은 장관 기능과 건강의 필수 지표이다37. 이러한 맥락에서, 대변 침전물의 다양한 매개 변수를 조사하기 위해 약물 함유 배지에서 D. melanogaster 를 사육하는 방법이 제안됩니다. 침전물 수를 모니터링하여 배변 빈도를 결정하고 약물이 장 통과에 영향을 미치는지 여부를 평가할 수 있습니다. 침전물의 전체 면적을 측정하여 대변의 농도와 희석을 평가할 수 있으며, 이는 장관의 전반적인 건강을 결정하는 데 중요한 요소입니다. 또한 총 통합 광학 밀도(IOD)를 사용하여 침전물에 존재하는 배설물 물질의 총량을 감지할 수 있습니다. 이 프로토콜은 장에 영향을 미치는 식물 추출물뿐만 아니라 약물을 선별하고 평가하는 효율적인 방법을 제공합니다. D. melanogaster 를 모델 유기체로 사용하면 잠재적인 약물의 효능을 평가할 수 있어 약물 발견 프로세스를 가속화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 식물 추출물에 이 방법을 적용함으로써 연구자들은 지사제로서의 사용을 검증하는 데 도움을 줄 수 있습니다.
D. melanogaster의 대변 침전물을 연구하기 위해 이 프로토콜을 사용할 때 고려해야 할 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 배지에서 원하는 약물 농도를 달성하는 데 필요한 질량을 계산하는 것이 중요합니다. 또한, 약물을 배지에 첨가할 때 양호한 준비 조건을 보장하는 것이 중요합니다., 고온은 약물을 분해하고 효능에 영향을 미칠 수 있기 때문에. 둘째, 이 프로토콜에서는 암컷 파리의 선택이 중요합니다. 처녀 암컷과 짝짓기 암컷 사이의 배설물 배출량 차이를 피하기 위해 처녀 암컷 파리를 사용하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 처녀 암컷에 의해 생성된 반점은 짝짓기 암컷보다 더 원형이며, 짝짓기 암컷은 처녀 암컷보다 더 많은 배설물을 배설하는 경향이 있다27,28. 따라서 수집 된 모든 암컷이 처녀인지 확인하기 위해 8 시간 전에 파리를 수집하는 것이 좋습니다. 또한 테스트된 파리는 건강이 음식 섭취와 배설물 배출량에 영향을 미칠 수 있으므로 강하고 건강해야 합니다. 예를 들어, 날개 모양이 비정상적인 파리는 먹이를 얻는 데 어려움을 겪을 수 있습니다. 마지막으로, T.U.R.D.를 성공적으로 사용하기 위해서는 블록 크기(픽셀)와 오프셋 설정이 중요합니다. 이미지의 빛 대비의 차이로 인해 배설물 침전물을 가장 잘 식별하기 위해 다른 설정을 시도해야 할 수도 있습니다.
제시된 방법은 효과적이지만 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 하나는 배지에서 약물 농도의 정확도입니다. 준비 중에 매체가 가열됨에 따라 일부 물이 증발하여 약물 농도에 영향을 줄 수 있습니다. 또 다른 제한 사항은 페트리 접시를 스캔하는 것입니다. 페트리 접시의 일부(즉, 가장자리)는 스캔되지 않으며, 이로 인해 총 배설물 침전물이 잘못 계산될 수 있습니다. 또한 파리는 페트리 접시의 상단 및 하단 덮개에 동일한 양의 배설물 침전물을 생성하지 않습니다. 하단 커버에 더 많은 침전물을 생성하는 경향이 있기 때문에 상단 커버와 하단 커버 사이의 분석 표준 편차가 높을 수 있으며, 이는 결과의 정확도에 영향을 미칠 수 있습니다.
이 프로토콜을 사용하여 연구원은 D. melanogaster의 설사를 연구할 수 있습니다. 약물 함유 배지를 변형시킴으로써 이 방법은 약물 발견에 대한 새로운 접근 방식을 제공하는 지사제 식물을 선별하는 데 사용할 수 있습니다. 전통 의학과 천연 제품은 수세기 동안 위장 장애를 포함한 다양한 질병을 치료하는 데 사용되어 왔습니다. 이 프로토콜을 사용하여 대변 침전물에 대한 식물 추출물의 효능을 평가함으로써 장관 장애에 대한 잠재적인 새로운 치료법을 식별하고 지사제로 사용하기 위한 과학적 근거를 제공할 수 있습니다. 이 접근법은 약물 발견 및 민족 약리학 분야에 귀중한 기여를 할 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
초파리 균주를 제공해 주신 Martina Gáliková 박사님께 감사드립니다. 연구에 대한 피드백을 제공하고 모델을 개선하는 데 도움을 준 Michelle Crozatier-Borde와 Marc Haenlin 팀에 감사드립니다. Crofelemer라는 약을 제공해 주신 Napo Pharmaceuticals Company에 감사드립니다. 저자들은 또한 이 프로토콜을 출판할 수 있는 기회를 제공해준 객원 편집자 Hugues Petitjean 박사에게 감사를 표합니다. 이 연구는 ANR-22-CE03-0001-01 프로젝트에 따라 ANR(Agence Nationale de la Recherche)의 자금 지원을 받았습니다.
Chemical & Food medium | |||
Agar | Sigma Aldrich | A7002 | 5 Kg bucket |
Bromophenol blue | Sigma Aldrich | 34725-61-6 | B5525-25G |
Corn flour | Nature et Cie | *910007 | 25 Kg bag |
Crofelemer | Napo pharmaceuticals | – | – |
Ethanol 96% | – | – | – |
Loperamide | Sigma Aldrich | L4762 | 5 grams |
Moldex | VWR | 1.06757.5000 | 5 Kg bag |
Propionic acid | Dutscher | 409553-CER | 1 Liter bottle |
Sugar | Pomona EpiSaveurs | 52705 | 1 Kg bag |
Yeast | Dutscher | 789195 | 10 Kg bag |
Materials | |||
Beaker | DWK LIFE SCIENCE | – | 250 mL |
Centrifugation tube | Eppendorf | 30119401 | Eppendorf tubes 5.0 mL |
CO2 tank | – | – | – |
Erlen Meyer flask | – | – | 500 mL (for extraction) |
Filter paper grade | Whatman | – | 3 mm chr. |
Flowbuddy socle | Genesis | – | – |
Flugs Narrow Plastic vials | Genesis | 49-102 | – |
Flystuff Blow gun | Genesis | – | – |
Flystuff Ultimate Flypad | Genesis | – | – |
Flystuff Foot pedal | Genesis | – | – |
Forceps | Dumostar | 11295-51 | – |
Graduated cylinder | – | – | 100 mL |
Inox spatula | – | – | – |
Micropipette | Eppendorf | 4924000088 | Eppendorf Reference 2 |
Micropipette tip | Eppendorf | 30000919 | epT.I.P.S. Standard |
Narrow Drosophila vials | Genesis | 32-120 | – |
Paintbrush | – | – | – |
Petri dish | Greiner | 628162 | Size: 60 x 15mm |
Round-bottom flask | – | – | 500 mL (for evaporation) |
Thermometer | Avantor | 620-0916 | |
Whisk | – | – | – |
Equipments | |||
Chiller | HUBER | Minichiller | – |
Heating bath | BÜCHI | B-490 | – |
Heating plate | BIOBLOCK SCIENTIFIC | – | Magnetic stirrer hot plate |
Incubator | Memmert | – | HPP110eco |
Rotary evaporator | BÜCHI | R-200 | – |
Scanner | Epson | V850 pro | – |
Shaker | Edmund Bühle | KS 10 | – |
Stereomicroscope binocular | Zeiss | Stemi 305 | – |
Vacuum pump | VACUUBRAND | PC500 series | – |
Vortex mixer | Sigma Aldrich | CLS6776-1EA | Corning LSE vortex mixers |
Weighing scale | OHAUS Scout | SKX622 | – |