Structurele en biochemische studies van menselijke membraantransporters vereisen milligramhoeveelheden stabiel, intact en homogeen eiwit. Hier beschrijven we schaalbare methoden om transporteurs van menselijke opgeloste stoffen te screenen, tot expressie te brengen en te zuiveren met behulp van codon-geoptimaliseerde genen.
Opgeloste stoffen (SLC’s) zijn membraantransporters die een reeks endogene en exogene substraten importeren en exporteren, waaronder ionen, voedingsstoffen, metabolieten, neurotransmitters en geneesmiddelen. Ondanks het feit dat deze groep eiwitten naar voren is gekomen als aantrekkelijke therapeutische doelwitten en markers van ziekte, is deze groep eiwitten nog steeds relatief ondergewaardeerd door de huidige geneesmiddelen. Projecten voor het ontdekken van geneesmiddelen voor deze transporters worden belemmerd door beperkte structurele, functionele en fysiologische kennis, uiteindelijk als gevolg van de moeilijkheden bij de expressie en zuivering van deze klasse van in membraan ingebedde eiwitten. Hier demonstreren we methoden om zeer zuivere milligrammen humane SLC-transporteiwitten te verkrijgen met behulp van codon-geoptimaliseerde gensequenties. In combinatie met een systematische verkenning van constructontwerp en high-throughput expressie, zorgen deze protocollen voor het behoud van de structurele integriteit en biochemische activiteit van de doeleiwitten. We belichten ook kritieke stappen in de eukaryote celexpressie, affiniteitszuivering en grootte-uitsluitingschromatografie van deze eiwitten. Uiteindelijk levert deze workflow zuivere, functioneel actieve en stabiele eiwitpreparaten op die geschikt zijn voor structuurbepaling met hoge resolutie, transportstudies, betrokkenheidstests voor kleine moleculen en in-vitroscreening met hoge doorvoer.
Membraaneiwitten zijn al lang het doelwit van zowel onderzoekers als de farmaceutische industrie. Hiervan zijn de opgeloste stoffen (SLC’s) een familie van meer dan 400 secundaire transportergenen die gecodeerd zijn in het menselijk genoom1. Deze transporters zijn betrokken bij de import en export van tal van moleculen, waaronder ionen2, neurotransmitters3, lipiden 4,5,6,7, aminozuren8, voedingsstoffen 9,10,11 pt geneesmiddelen 12. Met zo’n breed scala aan substraten zijn deze eiwitten ook betrokken bij een reeks pathofysiologieën door het transport van toxines13, transport van en remming door drugs van misbruik 14,15 of schadelijke mutaties16. Bacteriële homologen hebben gediend als prototypes voor het fundamentele transportmechanisme van verschillende SLC-families 17,18,19,20,21,22,23,24,25. In tegenstelling tot menselijke eiwitten komen prokaryote orthologen vaak beter tot expressie in het goed begrepen Escherichia coli-expressiesysteem 26,27 en zijn ze stabieler in de kleinere reinigingsmiddelen die goed geordende kristallen opleveren voor röntgenkristallografie28. Sequentie- en functionele verschillen bemoeilijken echter het gebruik van deze ver verwante eiwitten voor het ontdekken van geneesmiddelen29,30. Bijgevolg is directe studie van het menselijke eiwit vaak nodig om het werkingsmechanisme te ontcijferen van geneesmiddelen die gericht zijn op SLC’s 31,32,33,34,35. Hoewel de recente ontwikkelingen op het gebied van cryo-elektronenmicroscopie (Cryo-EM) structurele karakterisering van SLC’s in meer native-achtige omstandigheden mogelijk hebben gemaakt36,37, blijft de moeilijkheid om deze eiwitten tot expressie te brengen en te zuiveren een uitdaging voor het ontwikkelen van gerichte therapieën en diagnostiek.
Om deze uitdaging het hoofd te bieden, heeft het RESOLUTE-consortium (re-solute.eu) middelen en protocollen ontwikkeld voor de grootschalige expressie en zuivering van menselijke eiwitten uit de SLC-familie38. Beginnend met codon-geoptimaliseerde genen, hebben we methoden ontwikkeld voor het high-throughput klonen en screenen van SLC-constructen. Deze methoden werden systematisch toegepast op de hele familie van SLC’s, de genen werden gekloond in het BacMam-virale expressiesysteem en de eiwitexpressie werd getest in menselijke cellijnen39 op basis van eerder beschreven methoden voor klonen en expressietesten met hoge doorvoer40. Samengevat wordt het SLC-gen gekloond van het pDONR221-plasmide in een pHTBV1.1-vector. Dit construct wordt vervolgens gebruikt om het gen van belang te transponeren in een bacmidevector voor het transfecteren van insectencellen, die een cytomegaloviruspromotor en enhancer-elementen voor expressie in zoogdiercellen bevat. Het resulterende baculovirus kan worden gebruikt om zoogdiercellen te transduceren voor de expressie van het doel-SLC-eiwit.
We ontwikkelden verder gestandaardiseerde methoden voor grootschalige expressie en stabiele zuivering van geselecteerde SLC’s (Figuur 1). Dit protocol bevat meerdere controlepunten om effectieve probleemoplossing te vergemakkelijken en de variabiliteit tussen experimenten te minimaliseren. Met name routinematige monitoring van eiwitexpressie en lokalisatie, evenals kleinschalige optimalisatie van zuiveringsomstandigheden voor individuele doelen, werden geholpen door Strep en Green Fluorescent Protein (GFP) tags41,42.
Uiteindelijk kunnen deze chemisch zuivere en structureel homogene eiwitmonsters worden gebruikt voor structurele bepaling door middel van röntgenkristallografie of cryo-elektronenmicroscopie (Cryo-EM), biochemische target-engagement-assays, immunisatie voor het genereren van bindmiddelen en celvrije functionele studies via reconstitutie tot chemisch gedefinieerde liposomen.
De ontwikkeling van SLC-gerichte therapieën is belemmerd gebleven door het ontbreken van systematische karakterisering van de transporterfunctie. Dit heeft geleid tot onevenredig minder geneesmiddelen die zich op deze eiwitklasse richten in vergelijking met GPCR’s en ionkanalen63, ondanks hun talrijke rollen in normale en pathofysiologische processen. RESOLUTE is een internationaal consortium dat zich richt op het ontwikkelen van geavanceerde onderzoekstechnieken en -instrumenten om het huidige S…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd uitgevoerd binnen het RESOLUTE-project. RESOLUTE heeft financiering ontvangen van de Gemeenschappelijke Onderneming voor het initiatief innovatieve geneesmiddelen 2 in het kader van subsidieovereenkomst nr. 777372. Deze gemeenschappelijke onderneming wordt ondersteund door het onderzoeks- en innovatieprogramma Horizon 2020 van de Europese Unie en EFPIA. Dit artikel geeft alleen de mening van de auteurs weer en noch IMI, noch de Europese Unie en EFPIA zijn verantwoordelijk voor enig gebruik dat kan worden gemaakt van de informatie in het artikel. Het pHTBV-plasmide werd vriendelijk ter beschikking gesteld door Prof. Frederick Boyce (Harvard).
3C protease | Produced in-house | ||
50 or 100 kDa cut-off centrifugal concentrators | Sartorius | VS0242 | |
5-Cyclohexyl-1-Pentyl-β-D-Maltoside | Anatrace | C325 | CYMAL-5 |
96-well bacmid purification kit | Millipore | LSKP09604 | Montage Plasmid Miniprep |
96-well block (2 mL) | Greiner Bio-One | 780271 | |
Adhesive plastic seals | Qiagen | 19570 | Tape Pads |
Agarose size exclusion chromatography column | Cytiva | 29091596 | Superose 6 Increase 10/300 GL |
Benzonase DNAse | Produced in-house | ||
BisTris | Sigma Aldrich | B9754 | |
Cholesteryl Hemisuccinate Tris salt | Anatrace | CH210 | CHS |
Cobalt metal affinity resin | Takara Bio | 635653 | TALON Metal Affinity Resin |
D(+)-Biotin | Sigma Aldrich | 851209 | |
Dextran-agarose size exclusion chromatography column | Cytiva | 28990944 | Superdex 200 Increase 10/300 GL |
Digitonin | Apollo Scientific | BID3301 | |
Dounce tissue grinder (40 mL) | DWK Life Sciences | 357546 | |
EDTA-free protease inhibitor cocktail | Sigma Aldrich | 4693132001 | cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail |
Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10500064 | |
Fos-Choline-12 | Anatrace | F308S | FS-12 |
Glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | |
Glyco-diosgenin | Anatrace | GDN101 | GDN |
Gravity flow columns | Cole-Parmer | WZ-06479-25 | |
HEK293 medium | Thermo Fisher | 12338018 | FreeStyle 293 medium |
HEPES | Apollo Scientific | BI8181 | |
Hydrophilic, neutral silica UHPLC column | Sepax | 231300-4615 | Unix-C SEC-300 4.6 x 150 |
Imidazole | Sigma Aldrich | 56750 | |
Insect transfection reagent | Sigma Aldrich | 71259 | Reagent |
Lauryl Maltose Neopentyl Glycol | Anatrace | NG310 | LMNG |
Magnesium Chloride Hexahydrate | Sigma Aldrich | M2670 | |
Micro-expression shaker | Glas-Col | 107A DPMINC24CE | |
NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | |
n-Decyl-β-D-Maltoside | Anatrace | D322 | DM |
n-Dodecyl-b-D-Maltopyranoside | Anatrace | D310 | DDM |
n-Dodecyl-N,N-Dimethylamine-N-Oxide | Anatrace | D360 | LDAO |
n-Nonyl-β-D-Glucopyranoside | Anatrace | N324S | NG |
n-Octyl-d17-β-D-Glucopyranoside | Anatrace | O311D | OGNG |
Octaethylene Glycol Monododecyl Ether |
Anatrace | O330 | C12E8 |
Octyl Glucose Neopentyl Glycol | Anatrace | NG311 | OGNG |
Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537 | DPBS |
Polyoxyethylene(10)dodecyl Ether | Anatrace | AP1210 | C12E10 |
Polyoxyethylene(9)dodecyl Ether | Anatrace | APO129 | C12E9 |
Porous seal for tissue culture plates | VWR | 60941-084 | Rayon Films for Biological Cultures |
Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | |
Recombination enzyme mix | Thermo Fisher | 11791020 | Gateway LR Clonase II |
Serum-free insect media | Gibco | 10902088 | Sf-900 II serum-free media |
Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | 303410 | |
Sonicator 24-head probe | Sonics | 630-0579 | |
Sonicator power unit | Sonics | VCX 750 | |
Strep-Tactin resin | IBA Life Sciences | 2-5030-025 | Strep-TactinXT 4Flow high- capacity resin |
Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
Sucrose Monododecanoate | Anatrace | S350 | DDS |
Suspension-adapted HEK293 cells | Thermo Fisher | A14527 | Expi293F |
Transfection reagent | Sigma Aldrich | 70967 | GeneJuice Transfection Reagent |