マウスキメラ抗原受容体(CAR)-T細胞の効率的な作製
Summary
このプロトコルは、レトロウイルスベクターの生産とマウスT細胞の形質導入を合理化し、マウスCAR-T細胞の効率的な生成を促進します。
Abstract
キメラ抗原受容体(CAR)-T細胞を用いた改変細胞治療は、血液悪性腫瘍患者に対して目覚ましい効果を発揮し、現在、多様な固形腫瘍の治療のために開発が進められています。これまでのところ、新規CAR-T細胞産物の予備評価は、主に免疫不全マウスを用いた異種移植腫瘍モデルで行われてきた。このアプローチは、実験環境でヒトCAR-T細胞の生着を成功させるために選択されます。しかし、腫瘍とCAR-T細胞が同じマウス株に由来する同系マウスモデルでは、機能的な免疫系と包括的な腫瘍微小環境(TME)の文脈で新しいCAR技術を評価することができます。ここで説明するプロトコルは、レトロウイルス形質導入と ex vivo T細胞培養のための標準化された方法を提示することにより、マウスCAR-T細胞生成のプロセスを合理化することを目的としています。このプロトコルに記載されている方法は、この研究で使用されたもの以外の他のCARコンストラクトに適用して、免疫コンピテントシステムにおける新しいCARテクノロジーのルーチン評価を可能にします。
Introduction
キメラ抗原受容体(CAR)を発現する養子T細胞療法は、適応免疫系の力を利用して抗原陽性がん細胞を特異的に標的化して排除することにより、がん免疫療法の分野に革命をもたらしました1。B細胞悪性腫瘍を標的とするCAR-T細胞療法の成功は臨床的に検証されていますが、固形腫瘍を標的とする新しいCARの開発には、動物モデルで実施される前臨床試験が依然として不可欠です。しかし、これまでの固形腫瘍の適応症では臨床効果は限定的であり、個々の前臨床モデルでは生体医薬品の薬力学や臨床効果を正確に予測できないことがますます明らかになっています2,3。したがって、研究者らは、CAR-T細胞製品の前臨床試験を拡大し始めており、ヒトおよびマウスがんの異種移植モデルおよび同系モデルにおける並行評価をそれぞれ含めています。
ヒト腫瘍とT細胞を免疫不全マウスに生着させる異種移植モデルとは異なり、同系モデルでは、機能的な免疫系の文脈でCAR-T細胞応答を調べることができます。具体的には、同系腫瘍を有する免疫能力のあるマウスは、養子移植されたT細胞と、腫瘍微小環境(TME)におけるT細胞機能を抑制することが知られている腫瘍関連マクロファージ(TAM)および制御性T細胞(Treg)を含む状況特異的環境との間の相互作用を研究するシステムを提供します4,5,6.さらに、同系モデルは、オンターゲット、オフ腫瘍毒性、およびサイトカイン放出症候群などの追加の毒性につながる可能性のある宿主因子とのCAR-T細胞相互作用を評価するための追加のプラットフォームを提供します7。
これらの利点にもかかわらず、同系CAR-T細胞研究の数は依然として限られています。特に、同系モデルでは、同じマウス株由来のCAR-T細胞の自家工学が必要であり、効率的なマウスT細胞の形質導入とex vivo増殖のための方法論がないため、さらなる課題となっています2,8。このプロトコルはretroviralベクトルおよび最大限に活用されたT細胞のtransductionの生産によって安定したCARの表現を達成する方法を概説する。プロセス全体の概略図を図1に示します。このアプローチの使用は、マウスCAR-T細胞の効率的なレトロウイルス形質導入と、超遠心分離によるウイルス濃度を必要とせずに高いCAR発現を達成することを実証しています。CARコンストラクトの抗原特異性を変化させる戦略は、追加の導入遺伝子の共発現に加えて議論されています。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは生体 内の 調査のためのCAR-Tのセルを発生させるためにマウスT細胞のretroviralのtransductionに必要なステップおよび試薬を記述する。レトロウイルスの形質導入条件を最適化することで、超遠心分離や追加の試薬によるウイルス濃縮を必要とせずに、堅牢なCAR発現を実現します。ただし、この手法に適用できる変更は複数あります。
このプロトコル?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
原稿の批判的レビューをしてくれたL.Brockmannに感謝します。この研究は、NIH 1R01EB030352およびUL1 TR001873によってサポートされました。
Materials
| 0.45 μm filters | MilliporeSigma | SLHVR33RS | |
| 1 mL syringe | Fisher Scientific | 14-955-450 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-135 | |
| 10 mL syringe | BD | 14-823-16E | |
| 100 μm strainer | Corning | 07-201-432 | |
| 15 cm TC treated cell culture dishes | ThermoFisher Scientific | 130183 | |
| 15 mL conical tubes | Falcon | 14-959-70C | |
| 40 μm strainer | Corning | 07-201-430 | |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 14-959-49A | |
| 70 μm strainer | Corning | 07-201-431 | |
| Attune NxT Flow Cytometer | ThermoFisher Scientific | ||
| BALB/C, 6-8 week old | Jackson Laboratory | 651 | |
| B-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
| Bovine Serum Albumin | GOLDBIO | A-420-500 | |
| DMEM Medium | Gibco | 11965092 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), without Calcium and Magnesium | Gibco | 14-190-250 | |
| DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 12-321-D | |
| EasySep Magnet | Stemcell Technologies | 18000 | |
| EasySep Mouse T cell Isolation Kit | Stemcell Technologies | 19851 | |
| FACS buffer | BD | BDB554657 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | MT35011CV | |
| GlutaMAX | Gibco | 35-050-061 | |
| G-Rex6 | Wilson Wolf | 80240M | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15-630-080 | |
| Human recombinant IL-15 | Miltenyi Biotec | 130-095-765 | |
| Human recombinant IL-2 | Miltenyi Biotec | 130-097-748 | |
| Human recombinant IL-7 | Miltenyi Biotec | 130-095-363 | |
| Lipofectamine 3000 | Invitrogen | L3000008 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140-050 | |
| Mouse Anti-CD3 BV421 | Biolegend | 100228 | |
| Mouse Anti-CD3/CD28 Dynabeads | Gibco | 11-453-D | |
| Mouse Anti-CD4 BV605 | BD | 563151 | |
| Mouse Anti-CD44 APC | Biolegend | 103011 | |
| Mouse Anti-CD62L PE-Cy7 | Tonbo | SKU 60-0621-U025 | |
| Mouse Anti-CD8 APC-Cy7 | Tonbo | SKU 25-0081-U025 | |
| Nikon Ti2 with Prime 95B camera | Nikon | ||
| Non-treated 24 well plates | CytoOne | CC7672-7524 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31-985-062 | |
| pCL-Eco | Addgene | #12371 | |
| Penicillin/Streptomycin Solution | Gibco | 15-070-063 | |
| Phoenix Eco cells | ATCC | CRL-3214 | |
| pMDG.2 | Addgene | #12259 | |
| pMSCV_PGK_GFP28z | N/A | Produced by R.LV. | |
| Purified sfGFP | N/A | Produced by R.LV. | |
| RetroNectin ('transduction reagent') | Takara Bio | T100B | |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875 | |
| Serological pipette 10 mL | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Serological pipette 25 mL | Fisher Scientific | 13-678-11 | |
| Serological pipette 5 mL | Fisher Scientific | 13-678-11D | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11-360-070 | |
| TC-treated 24 well plates | Corning | 08-772-1 | |
| Trypan blue | Gibco | 15-250-061 |
Referências
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