Otimizando a cultura de células epiteliais primárias de lente de camundongo: um guia abrangente para tripsinização
Summary
Este manuscrito descreve um protocolo de vídeo detalhado para a cultura de células epiteliais primárias do cristalino (LECs), com o objetivo de melhorar a reprodutibilidade e auxiliar a pesquisa em catarata e opacificação da cápsula posterior (PCO). Ele oferece instruções passo a passo sobre dissecção de lentes, isolamento de LECs e validação, servindo como um guia valioso, especialmente para recém-chegados no campo.
Abstract
As células epiteliais do cristalino (LECs) desempenham múltiplos papéis importantes na manutenção da homeostase e da função normal do cristalino. Os LECs determinam o crescimento, o desenvolvimento, o tamanho e a transparência das lentes. Por outro lado, as CLEs disfuncionais podem levar à formação de catarata e opacificação da cápsula posterior (PCO). Consequentemente, o estabelecimento de um sistema de cultura LEC primário robusto é importante para pesquisadores envolvidos no desenvolvimento de lentes, bioquímica, terapêutica de catarata e prevenção de PCO. No entanto, o cultivo de LECs primárias há muito tempo apresenta desafios devido à sua disponibilidade limitada, taxa de proliferação lenta e natureza delicada.
Este estudo aborda esses obstáculos apresentando um protocolo abrangente para cultura LEC primária. O protocolo engloba etapas essenciais, como a formulação de um meio de cultura otimizado, isolamento preciso das cápsulas do cristalino, técnicas de tripsinização, procedimentos de subcultivo, protocolos de colheita e diretrizes para armazenamento e embarque. Durante todo o processo de cultivo, a morfologia celular foi monitorada por meio de microscopia de contraste de fase.
Para confirmar a autenticidade das LECs cultivadas, ensaios de imunofluorescência foram conduzidos para detectar a presença e a distribuição subcelular de proteínas críticas do cristalino, ou seja, αA- e γ-cristalinos. Este protocolo detalhado fornece aos pesquisadores um recurso valioso para cultivar e caracterizar LECs primárias, permitindo avanços em nossa compreensão da biologia do cristalino e o desenvolvimento de estratégias terapêuticas para distúrbios relacionados ao cristalino.
Introduction
A lente do olho desempenha um papel crucial na visão, concentrando a luz recebida na retina. Consiste em uma estrutura avascular transparente composta por células especializadas, entre as quais as células epiteliais do cristalino (LECs) são peças-chave. As CLEs estão localizadas na superfície anterior do cristalino e são responsáveis por manter sua transparência, regular o balanço hídrico e participar do crescimento e desenvolvimento do cristalino 1,2. LECs são um tipo único de células localizadas na parte anterior da lente, desempenhando um papel crítico na manutenção da clareza e função da lente, produzindo continuamente fibras da lente ao longo da vida.
A catarata caracteriza-se pela turvação progressiva do cristalino, resultando em distorção e espalhamento da luz, levando ao comprometimento da visão 3,4. Os mecanismos precisos subjacentes à formação da catarata são complexos e multifatoriais, envolvendo vários processos celulares e moleculares, como radiação UV, dano oxidativo e glicação 5,6. Descobriu-se que as LECs contribuem significativamente para o desenvolvimento da catarata, tornando-as um foco vital de pesquisa 1,2,7,8,9.
Além disso, uma das questões mais prementes em oftalmologia atualmente é a incidência relativamente alta de opacificação da cápsula posterior (PCO), também conhecida como catarata secundária. A PCO continua sendo a complicação mais comum após a cirurgia de catarata, afetando até 20-40% dos pacientes adultos e 100% das crianças dentro de 5 anos após a cirurgia10. A PCO é causada principalmente pelas LECs residuais que permanecem na bolsa capsular após a extração da catarata. Essas células sofrem uma transformação fisiopatológica multifacetada, envolvendo não apenas a transição epitélio-mesenquimal (EMT), mas também a diferenciação das LECs em fibras do cristalino, resultando em uma população celular que é uma mistura de LECs, fibras e miofibroblastos11,12,13. As células transformadas proliferam e migram através da cápsula posterior do cristalino, levando à deficiência visual. A compreensão do comportamento e dos mecanismos de controle das LECs em modelos de cultura pode fornecer informações valiosas sobre a prevenção e o manejo da PCO. Portanto, este protocolo de cultivo de LECs apresenta-se como uma ferramenta vital para os pesquisadores oftalmológicos com o objetivo de estudar, compreender e, finalmente, combater essa complicação pós-operatória prevalente.
Para desvendar os meandros da biologia LEC e seu papel na formação de catarata e PCO, é essencial estabelecer sistemas de cultura de células primárias robustos e reprodutíveis. A cultura primária de LEC fornece aos pesquisadores um ambiente controlado para estudar as funções, sinalização e características moleculares de LECs. Além disso, permite a investigação de processos celulares e dos efeitos de diferentes condições experimentais, fornecendo informações valiosas sobre a fisiologia e patologia do cristalino.
Pesquisas anteriores enriqueceram nosso entendimento sobre as técnicas de cultura LEC 14,15,16,17,18,19,20. Embora esses estudos tenham empregado várias metodologias e produzido achados significativos sobre o comportamento e as características do LEC, um protocolo de videogravação abrangente e acessível para a cultura de LECs está ausente na literatura atual. Essa limitação pode dificultar a capacidade de pesquisadores iniciantes em reproduzir com precisão as técnicas e pode levar a inconsistências e variações nos resultados experimentais. Ao fornecer um protocolo de gravação de vídeo, este artigo de pesquisa visa preencher essa lacuna e fornecer um recurso padronizado que possa aumentar a reprodutibilidade e facilitar a transferência de conhecimento no campo da cultura LEC.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo apresentado neste artigo fornece um guia passo a passo abrangente para o isolamento, a cultura e a subcultura bem-sucedidos de LECs primários, completo com a documentação em vídeo que o acompanha. O guia visual detalhado, juntamente com as instruções escritas, aumenta a clareza e a acessibilidade do protocolo, promovendo seu uso e reprodutibilidade entre os pesquisadores da área. O objetivo final é contribuir para a expansão do corpo de conhecimento em torno do papel das CELs na formação da catarat…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo NEI R21EY033941 (para Hongli Wu); Departamento de Defesa W81XWH2010896 (para Hongli Wu); R15GM123463-02 (para Kayla Green e Hongli Wu)
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher | #25300054 | For LECs dissociation |
| Alexa Fluor 488 Secondary Antibody | Jackson ImmunoResearch | #715-545-150 | For cell validation |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-605-003 | For cell validation |
| Antibody dilution buffer | Licor | #927-60001 | For cell validation |
| Beaver safety knife | Beaver-Visitec International | #3782235 | For lens dissection |
| Blocking buffer | Licor | #927-60001 | For cell validation |
| Capsulorhexis forceps | Titan Medical Instruments | TMF-124 | For lens capsule isolation |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6429 | For LECs culture medium |
| DMSO | Sigma Aldrich | #D2650 | For making freezing medium |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher | #J67802 | For lens dissection |
| Dumont tweezers | Roboz Surgical Instrument | RS-4976 | For lens capsule isolation |
| EpiCGS-a (optional) | ScienCell | 4182 | For LECs culture medium |
| FBS | Sigma Aldrich | F2442 | For LECs culture medium |
| Gentamicin (50 mg/mL) | Sigma-Aldrich | G1397 | For LECs culture medium |
| Hoechst 33342 solution | Thermo Fisher | #62249 | For cell validation |
| Micro-dissecting scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5983 | For lens dissection |
| Micro-dissecting tweezers | Roboz Surgical Instrument | RS5137 | For lens dissection |
| PROX1 antibody | Thermo Fisher | 11067-2-AP | For cell validation |
| Vannas micro-dissecting spring scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5608 | For lens capsule isolation |
| αA-crystallin antibody | Santa Cruz | sc-28306 | For cell validation |
| γ-crystallin antibody | Santa Cruz | sc-365256 | For cell validation |
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