प्राइमर्डियल जर्म सेल क्रायोप्रिजर्वेशन और ड्रोसोफिला उपभेदों का पुनरुद्धार
Summary
ताजा खाद्य शीशियों के लिए वयस्क मक्खियों के लगातार हस्तांतरण के विकल्प के रूप में ड्रोसोफिला उपभेदों के लिए एक दीर्घकालिक संरक्षण विधि अत्यधिक वांछनीय है। यह प्रोटोकॉल ड्रोसोफिला प्राइमर्डियल जर्म कोशिकाओं के क्रायोप्रिजर्वेशन का वर्णन करता है और एगेमेटिक होस्ट भ्रूण में उनके प्रत्यारोपण के माध्यम से तनाव पुनरुद्धार का वर्णन करता है।
Abstract
ड्रोसोफिला उपभेदों को वयस्क मक्खियों के नए शीशियों में लगातार हस्तांतरण द्वारा बनाए रखा जाना चाहिए। इससे म्यूटेशनल बिगड़ने और फेनोटाइपिक परिवर्तनों का खतरा होता है। इसलिए इस तरह के परिवर्तनों के बिना दीर्घकालिक संरक्षण के लिए एक वैकल्पिक विधि का विकास अनिवार्य है। पिछले सफल प्रयासों के बावजूद, ड्रोसोफिला भ्रूण का क्रायोप्रिजर्वेशन अभी भी कम प्रजनन क्षमता के कारण व्यावहारिक उपयोग का नहीं है। यहां, हम प्राइमर्डियल जर्म सेल (पीजीसी) क्रायोप्रेज़र्वेशन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं और क्रायोप्रेज़र्व्ड पीजीसी के प्रत्यारोपण के माध्यम से एगेमेटिक ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर (डी. मेलानोगास्टर) मेजबान भ्रूण में प्रजनन करते हैं। पीजीसी क्रायोप्रोटेक्टिव एजेंटों (सीपीए) के लिए अत्यधिक पारगम्य हैं, और भ्रूण क्रायोप्रिजर्वेशन की तुलना में उपभेदों के बीच विकासात्मक और रूपात्मक भिन्नता कम समस्याग्रस्त है। इस विधि में, पीजीसी को लगभग 30 दाता भ्रूणों से एकत्र किया जाता है, सीपीए उपचार के बाद एक सुई में लोड किया जाता है, और फिर तरल नाइट्रोजन में क्रायोप्रेज़र्ड किया जाता है। दाता-व्युत्पन्न युग्मकों का उत्पादन करने के लिए, एक सुई में क्रायोप्रिजर्व पीजीसी को पिघलाया जाता है और फिर लगभग 15 एगेमेटिक मेजबान भ्रूण में जमा किया जाता है। इस प्रोटोकॉल के साथ कम से कम 15% उपजाऊ मक्खियों की आवृत्ति हासिल की गई थी, और प्रति उपजाऊ जोड़े में संतान की संख्या हमेशा मूल तनाव को पुनर्जीवित करने के लिए पर्याप्त से अधिक थी (औसत संतान संख्या 77.2 ± 7.1 थी), जो क्रायोप्रेज़र्व्ड पीजीसी की जर्मलाइन स्टेम सेल बनने की क्षमता को दर्शाता है। प्रति सुई उपजाऊ मक्खियों की औसत संख्या 1.1 ± 0.2 थी, और 26 सुइयों में से 9 ने दो या अधिक उपजाऊ संतान का उत्पादन किया। यह पाया गया कि 11 सुइयां 6 या अधिक संतान पैदा करने के लिए पर्याप्त हैं, जिसमें कम से कम एक महिला और एक नर शामिल होने की संभावना है। एगैमेटिक होस्ट केवल नई उभरी हुई मादा और नर मक्खियों को पार करके तनाव को जल्दी से पुनर्जीवित करना संभव बनाता है। इसके अलावा, पीजीसी में जेनेटिक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों में उपयोग किए जाने की क्षमता है, जैसे कि जीनोम संपादन।
Introduction
नई खाद्य शीशियों के लिए वयस्क मक्खियों के हस्तांतरण से ड्रोसोफिला उपभेदों के रखरखाव अनिवार्य रूप से समय के साथ उत्परिवर्तन और epigenetic परिवर्तन के संचय में परिणाम. इस तरह के परिवर्तनों के बिना ड्रोसोफिला उपभेदों के दीर्घकालिक रखरखाव के लिए एक वैकल्पिक विधि का विकास अनिवार्य है, विशेष रूप से संदर्भ उपभेदों के लिए जिसमें पूरे जीनोम को बनाए रखा जाना है। ड्रोसोफिला भ्रूण या अंडाशय क्रायोप्रिजर्व करने के कई सफल प्रयासों का वर्णन किया गया है: 1,2,3। दुर्भाग्य से, वे अभी भी कम प्रजनन क्षमता के कारण व्यावहारिक उपयोग के नहीं हैं। दरअसल, प्रारंभिक चरण के भ्रूण में क्रायोप्रेज़र्वेशन के बाद उनकी उच्च जर्दी सामग्री के कारण जीवित रहने की दर कम होती है, जो क्रायोप्रोटेक्टिव एजेंट (सीपीए) पारगम्यता औरप्रसार 2,3 को बाधित करती है। सीपीए पारगम्यता भी देर से चरण भ्रूण की मोमी परतों द्वारा गंभीर रूप से सीमित है। यह मुश्किल और समय लेने वाली एक तनाव विशिष्ट समय अवधि है जिसमें भ्रूण एक उच्च जीवित रहने की दर और एक पतली मोम परत है खोजने के लिए है. हाल ही में, झान एट अल.4 भ्रूण पारगम्यता, सीपीए लोडिंग, और विट्रीफिकेशन और कई उपभेदों के सफलतापूर्वक क्रायोप्रेज़र्व्ड भ्रूण के लिए बेहतर तरीके। हालांकि, विधियों को लागू करना आसान नहीं है क्योंकि पारगम्यता के बाद भ्रूण की व्यवहार्यता खराब हो जाती है। इसलिए, वैकल्पिक दृष्टिकोणों के आगे सुधार और विकास की अभी भी आवश्यकता है। प्राइमर्डियल जर्म सेल (पीजीसी) के क्रायोप्रिजर्वेशन से जुड़े तरीके ड्रोसोफिला उपभेदों के दीर्घकालिक रखरखाव के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण हैं।
पीजीसी (जिसे पोल सेल भी कहा जाता है) प्रत्यारोपण का उपयोग जर्मलाइन काइमेरा, विशेष रूप से महिलाओं को उत्पन्न करने के लिए किया गया है, ताकि जाइगोटिक घातक उत्परिवर्तन के मातृ प्रभाव और रोगाणु कोशिकाओं के लिंग निर्धारणजैसी प्रक्रियाओं का अध्ययन किया जा सके 5,6,7,8,9,10,11,12 . पीजीसी भ्रूण की तुलना में बहुत छोटे होते हैं और अधिकांश क्रायोप्रोटेक्टेंट के लिए अत्यधिक पारगम्य होने की संभावना है। इसके अलावा, उपभेदों के बीच विकासात्मक और रूपात्मक भिन्नता कम समस्याग्रस्त है, और एक एगामेटिक होस्ट पूरे जीनोम की त्वरित बहाली को सक्षम बनाता है। हमने हाल ही में पीजीसी क्रायोप्रिजर्वेशन13 की एक नई विधि विकसित की है, जो ड्रोसोफिला उपभेदों में अन्यथा अपरिहार्य आनुवंशिक और एपिजेनेटिक परिवर्तनों को रोकता है। यहां, हम विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।
इस क्रायोप्रिजर्वेशन विधि के लिए पीजीसी हैंडलिंग और इंस्ट्रूमेंटेशन में विशिष्ट विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है। जबकि चरण-दर-चरण दृष्टिकोण उन लोगों के लिए एक कुशल समाधान हो सकता है जो इससे अपरिचित हैं, यह इंस्ट्रूमेंटेशन आवश्यकताओं के कारण छोटी प्रयोगशालाओं के लिए अनुपयुक्त हो सकता है। इस पीजीसी क्रायोप्रेज़र्वेशन प्रोटोकॉल को छोटे विकास और रूपात्मक मतभेदों के कारण भ्रूण क्रायोप्रेज़र्वेशन प्रोटोकॉल की तुलना में विभिन्न ड्रोसोफिला प्रजातियों और विभिन्न कीट प्रजातियों के साथ उपयोग के लिए अधिक आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है। पीजीसी का उपयोग संभावित रूप से जेनेटिक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों में भी किया जा सकता है, जैसे जीनोम संपादन 14,15,16। सारांश में, इस पद्धति का उपयोग स्टॉक केंद्रों और अन्य प्रयोगशालाओं में बिना किसी बदलाव के लंबे समय तक मक्खी और अन्य कीट उपभेदों को बनाए रखने के लिए किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
पीजीसी क्रायोप्रिजर्वेशन और पुनरुद्धार में सफलता के लिए एक महत्वपूर्ण कारक अच्छे भ्रूण का उपयोग करना है। भ्रूण संग्रह के लिए युवा महिलाओं (जैसे, 3- से 5 दिन पुरानी) का उपयोग किया जाना चाहिए। दोनों दाता औ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम मक्खी उपभेदों के लिए क्योटो ड्रोसोफिला स्टॉक सेंटर को धन्यवाद देते हैं। हम पांडुलिपि के अंग्रेजी भाषा संपादन के लिए सुश्री वांडा मियाता और इस पांडुलिपि के मसौदे को संपादित करने के लिए एडान्ज़ (https://jp.edanz.com/ac) से डॉ. जेरेमी एलन को भी धन्यवाद देते हैं। इस काम को जापान एजेंसी फॉर मेडिकल रिसर्च एंड डेवलपमेंट (AMED) से T.T.-S.K., अनुदान (JP16km0210073, JP18km0210145, JP18km0210145) से अनुदान (JP16km0210073, JP17km0210147, JP18km0210145) द्वारा समर्थित किया गया था। और एस.के., जापान सोसाइटी फॉर द प्रमोशन ऑफ साइंस (JSPS) से T.T.-S.-K तक वैज्ञानिक अनुसंधान (C) (JP19K06780) के लिए अनुदान, और JSPS से S.K. तक अभिनव क्षेत्रों (JP18H05552) पर वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए अनुदान-सहायता
Materials
| Acetic acid | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 017-00256 | For embryo collection |
| Agar powder | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 010-08725 | For embryo collection |
| Calcium chloride | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 038-24985 | For EBR solution |
| Capillary | Sutter Instrument | B100-75-10-PT | BOROSILICATE GLASS; O.D: 1.0mm, I.D: 0.75mm , length: 10cm, 225Pcs |
| Capillary holder | Eppendorf | 5196 081.005 | Capillary holder 4; for micromanipulation |
| Chromic acid mixture | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 037-05415 | For needle washing |
| CPA solution | 1x EBR containing 20% ethylene glycol and 1M sucrose | ||
| Double-sided tape | 3M | Scotch w-12 | For glue extracting |
| Ephrussi–Beadle Ringer solution (EBR) | 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, and 10 mM Hepes at pH 6.9 | ||
| Ethanol (99.5) | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 057-00451 | For embryo collection |
| Ethylene glycol | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 054-00983 | For CPA solution |
| Falcon 50 mm x 9 mm bacteriological petri dish | Corning Inc. | 351006 | For embryo collection |
| Forceps | Vigor | Type5 Titan | For embryo handling |
| Grape juice | Asahi Soft Drinks Co., LTD. | Welch's Grape 100 | For embryo collection |
| Grape juice agar plate | 50% grape juice, 2% agar, 1% ethanol, 1% acetic acid | ||
| Heptane | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 084-08105 | For glue extracting |
| Humidifier | APIX INTERNATIONAL CO., LTD. | FSWD2201-WH | For embryo preparation |
| Inverted microscope | Leica Microsystems GmbH | Leica DM IL LED | For micromanipulation |
| Luer-lock glass syringe | Tokyo Garasu Kikai Co., Ltd. | 0550 14 71 08 | Coat a plunger with silicon oil (FL-100-450CS);for micromanipulation |
| Mechanical micromanipulator | Leica Microsystems GmbH | For micromanipulation | |
| Micro slide glass | Matsunami Glass Ind., Ltd. | S-2441 | For embryo aligning |
| Microgrinder | NARISHIGE Group | Custom order | EG-401-S combined EG-401 and MF2 (with ocular lens MF2-LE15 ); for needle preparation |
| Microscope camera | Leica Microsystems GmbH | Leica MC170 HD | For micromanipulation |
| Needle holder | Merck KGaA | Eppendorf TransferTip (ES) | For cryopreservation |
| Potassium chloride | Nacalai Tesque, Inc. | 28514-75 | For EBR solution |
| Puller | NARISHIGE Group | PN-31 | For needle preparation; the heater level is set to 85.0-98.4, the magnet main level to 57.8, and the magnet sub level to 45.0. |
| PVC adhesive tape for electric insulation | Nitto Denko Corporation | J2515 | For embryo-pool frame |
| Silicon oil | Shin-Etsu Chemical, Co, Ltd. | FL-100-450CS | For embryo handling |
| Sodium chloride | Nacalai Tesque, Inc. | 31320-05 | For EBR solution |
| Sodium hypochlorite solution | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 197-02206 | Undiluted and freshly prepared; for embryo breaching |
| Sucrose | Nacalai Tesque, Inc. | 30404-45 | For CPA solution |
Referências
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