Criopreservación de células germinales primordiales y reactivación de cepas de Drosophila
Summary
Es muy deseable un método de conservación a largo plazo para las cepas de Drosophila como alternativa a la transferencia frecuente de moscas adultas a viales de alimentos frescos. Este protocolo describe la criopreservación de células germinales primordiales de Drosophila y la reactivación de cepas a través de su trasplante a embriones de huésped agavésico.
Abstract
Las cepas de Drosophila deben mantenerse mediante la transferencia frecuente de moscas adultas a nuevos viales. Esto conlleva un peligro de deterioro mutacional y cambios fenotípicos. Por lo tanto, es imperativo desarrollar un método alternativo para la conservación a largo plazo sin tales cambios. A pesar de los intentos exitosos anteriores, la criopreservación de embriones de Drosophila todavía no es de utilidad práctica debido a su baja reproducibilidad. Aquí, describimos un protocolo para la criopreservación de células germinales primordiales (PGC) y la reactivación de cepas mediante el trasplante de PGC criopreservadas en embriones hospedadores de Drosophila melanogaster (D. melanogaster) agastéticos. Las CGP son altamente permeables a los agentes crioprotectores (CPA), y la variación morfológica y de desarrollo entre cepas es menos problemática que en la criopreservación de embriones. En este método, las PGC se recolectan de aproximadamente 30 embriones de donantes, se cargan en una aguja después del tratamiento con CPA y luego se criopreservan en nitrógeno líquido. Para producir gametos derivados de donantes, las PGC criopreservadas en una aguja se descongelan y luego se depositan en aproximadamente 15 embriones de huésped agastético. Con este protocolo se logró una frecuencia de al menos un 15% de moscas fértiles, y el número de progenie por pareja fértil fue siempre más que suficiente para revivir la cepa original (el número promedio de progenie es de 77,2 ± 7,1), lo que indica la capacidad de las PGC criopreservadas para convertirse en células madre de la línea germinal. El número promedio de moscas fértiles por acícula fue de 1,1 ± 0,2, y 9 de 26 acículas produjeron dos o más progenies fértiles. Se encontró que 11 agujas son suficientes para producir 6 o más descendientes, en las que probablemente se incluyan al menos una hembra y un macho. El huésped agagmático permite revivir la cepa rápidamente simplemente cruzando moscas hembra y macho recién emergidas. Además, las PGC tienen el potencial de ser utilizadas en aplicaciones de ingeniería genética, como la edición del genoma.
Introduction
El mantenimiento de cepas de Drosophila mediante la transferencia de moscas adultas a nuevos viales de alimento resulta inevitablemente en la acumulación de mutaciones y cambios epigenéticos a lo largo del tiempo. Es imperativo desarrollar un método alternativo para el mantenimiento a largo plazo de las cepas de Drosophila sin tales cambios, especialmente para las cepas de referencia en las que se debe mantener el genoma completo. Se han descrito varios intentos exitosos de criopreservar embriones u ovarios de Drosophila 1,2,3. Desafortunadamente, todavía no son de uso práctico debido a su baja reproducibilidad. De hecho, los embriones en estadios tempranos tienen una baja tasa de supervivencia después de la criopreservación debido a su alto contenido en yema, lo que impide la permeabilidad y difusión del agente crioprotector (CPA) 2,3. La permeabilidad a la CPA también está severamente limitada por las capas cerosas de los embriones en etapa tardía. Es difícil y requiere mucho tiempo encontrar un período de tiempo específico de la cepa en el que los embriones tengan una alta tasa de supervivencia y una capa de cera más delgada. Recientemente, Zhan et al.4 mejoraron los métodos de permeabilización embrionaria, carga de CPA y vitrificación y criopreservaron con éxito embriones de múltiples cepas. Sin embargo, los métodos no son fáciles de aplicar porque la viabilidad de los embriones después de la permeabilización tiende a ser pobre. Por lo tanto, todavía es necesario seguir mejorando y desarrollando enfoques alternativos. Los métodos que implican la criopreservación de células germinales primordiales (PGC) son un enfoque alternativo para el mantenimiento a largo plazo de las cepas de Drosophila.
El trasplante de PGC (también llamado de células polares) se ha utilizado para generar quimeras de la línea germinal, especialmente en hembras, para estudiar procesos como los efectos maternos de las mutaciones letales cigóticas y la determinación del sexo de las células germinales 5,6,7,8,9,10,11,12 . Las CGP son mucho más pequeñas que los embriones y es probable que sean muy permeables a la mayoría de los crioprotectores. Además, la variación morfológica y de desarrollo entre cepas es menos problemática, y un huésped agastático permite una rápida restauración de genomas completos. Recientemente hemos desarrollado un nuevo método de criopreservación de PGC13, que previene los cambios genéticos y epigenéticos que de otro modo serían inevitables en las cepas de Drosophila. A continuación, presentamos el protocolo detallado.
Este método de criopreservación requiere conocimientos específicos en el manejo e instrumentación de PGC. Si bien un enfoque paso a paso puede ser una solución eficiente para aquellos que no están familiarizados con él, puede no ser adecuado para laboratorios pequeños debido a los requisitos de instrumentación. Este protocolo de criopreservación de PGC se puede adaptar más fácilmente para su uso con diferentes especies de Drosophila y diferentes especies de insectos que los protocolos de criopreservación de embriones debido a las diferencias morfológicas y de desarrollo más pequeñas. Las PGC también pueden utilizarse potencialmente en aplicaciones de ingeniería genética, como la edición del genoma 14,15,16. En resumen, este método se puede utilizar en centros de almacenamiento y otros laboratorios para mantener las cepas de moscas y otros insectos durante períodos prolongados de tiempo sin cambios.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un factor crítico para el éxito en la criopreservación y reactivación de PGC es el uso de buenos embriones. Se deben utilizar hembras jóvenes (p. ej., de 3 a 5 días de edad) para la recolección de embriones. Tanto los embriones de la donante como los del huésped se evalúan mediante inspección microscópica, y solo se utilizan los que se encuentran en la etapa de blastodermo (etapa 5)12. Para la recolección de PGC, generalmente alineamos aproximadamente 40 embriones de donantes en un per…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al KYOTO Drosophila Stock Center por las cepas de moscas. También agradecemos a la Sra. Wanda Miyata por la edición en inglés del manuscrito y al Dr. Jeremy Allen de Edanz (https://jp.edanz.com/ac) por editar un borrador de este manuscrito. Este trabajo contó con el apoyo de subvenciones (JP16km0210072, JP17km0210146, JP18km0210146) de la Agencia Japonesa de Investigación y Desarrollo Médico (AMED) a T.T.-S.-K., subvenciones (JP16km0210073, JP17km0210147, JP18km0210145) de AMED a S.K., una subvención (JP20km0210172) de AMED a T.T.-S.-K. y S.K., una subvención para la investigación científica (C) (JP19K06780) de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS) a T.T.-S.-K., y una subvención para la investigación científica en áreas innovadoras (JP18H05552) de JSPS a S.K.
Materials
| Acetic acid | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 017-00256 | For embryo collection |
| Agar powder | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 010-08725 | For embryo collection |
| Calcium chloride | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 038-24985 | For EBR solution |
| Capillary | Sutter Instrument | B100-75-10-PT | BOROSILICATE GLASS; O.D: 1.0mm, I.D: 0.75mm , length: 10cm, 225Pcs |
| Capillary holder | Eppendorf | 5196 081.005 | Capillary holder 4; for micromanipulation |
| Chromic acid mixture | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 037-05415 | For needle washing |
| CPA solution | 1x EBR containing 20% ethylene glycol and 1M sucrose | ||
| Double-sided tape | 3M | Scotch w-12 | For glue extracting |
| Ephrussi–Beadle Ringer solution (EBR) | 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, and 10 mM Hepes at pH 6.9 | ||
| Ethanol (99.5) | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 057-00451 | For embryo collection |
| Ethylene glycol | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 054-00983 | For CPA solution |
| Falcon 50 mm x 9 mm bacteriological petri dish | Corning Inc. | 351006 | For embryo collection |
| Forceps | Vigor | Type5 Titan | For embryo handling |
| Grape juice | Asahi Soft Drinks Co., LTD. | Welch's Grape 100 | For embryo collection |
| Grape juice agar plate | 50% grape juice, 2% agar, 1% ethanol, 1% acetic acid | ||
| Heptane | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 084-08105 | For glue extracting |
| Humidifier | APIX INTERNATIONAL CO., LTD. | FSWD2201-WH | For embryo preparation |
| Inverted microscope | Leica Microsystems GmbH | Leica DM IL LED | For micromanipulation |
| Luer-lock glass syringe | Tokyo Garasu Kikai Co., Ltd. | 0550 14 71 08 | Coat a plunger with silicon oil (FL-100-450CS);for micromanipulation |
| Mechanical micromanipulator | Leica Microsystems GmbH | For micromanipulation | |
| Micro slide glass | Matsunami Glass Ind., Ltd. | S-2441 | For embryo aligning |
| Microgrinder | NARISHIGE Group | Custom order | EG-401-S combined EG-401 and MF2 (with ocular lens MF2-LE15 ); for needle preparation |
| Microscope camera | Leica Microsystems GmbH | Leica MC170 HD | For micromanipulation |
| Needle holder | Merck KGaA | Eppendorf TransferTip (ES) | For cryopreservation |
| Potassium chloride | Nacalai Tesque, Inc. | 28514-75 | For EBR solution |
| Puller | NARISHIGE Group | PN-31 | For needle preparation; the heater level is set to 85.0-98.4, the magnet main level to 57.8, and the magnet sub level to 45.0. |
| PVC adhesive tape for electric insulation | Nitto Denko Corporation | J2515 | For embryo-pool frame |
| Silicon oil | Shin-Etsu Chemical, Co, Ltd. | FL-100-450CS | For embryo handling |
| Sodium chloride | Nacalai Tesque, Inc. | 31320-05 | For EBR solution |
| Sodium hypochlorite solution | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 197-02206 | Undiluted and freshly prepared; for embryo breaching |
| Sucrose | Nacalai Tesque, Inc. | 30404-45 | For CPA solution |
Referências
- Brüschweiler, W., Gehring, W. A method for freezing living ovaries of Drosophila melanogaster larvae and its application to the storage of mutant stocks. Experientia. 29, 134-135 (1973).
- Steponkus, P. L., et al. Cryopreservation of Drosophila melanogaster embryos. Nature. 345, 170-172 (1990).
- Mazur, P., Cole, K. W., Hall, J. W., Schreuders, P. D., Mahowald, A. P. Cryobiological preservation of Drosophila embryos. Science. 258 (5090), 1932-1935 (1992).
- Zhan, L., Li, M. G., Hays, T., Bischof, J. Cryopreservation method for Drosophila melanogaster embryos. Nat Comm. 12, 2412 (2021).
- Van Deusen, E. B. Sex determination in germ line chimeras of Drosophila melanogaster. Development. 37 (1), 173-185 (1977).
- Breen, T. R., Duncan, I. M. Maternal expression of genes that regulate the bithorax complex of Drosophila melanogaster. Dev Biol. 118, 442-456 (1986).
- Schupbach, T., Wieschaus, E. Germline autonomy of maternal-effect mutations altering the embryonic body pattern of Drosophila. Dev Biol. 113, 443-448 (1986).
- Irish, V., Lehmann, R., Akam, M. The Drosophila posterior-group gene nanos functions by repressing hunchback activity. Nature. 338, 646-648 (1989).
- Hülskamp, M., Schröder, C., Pfeifle, C., Jäckle, H., Tautz, D. Posterior segmentation of the Drosophila embryo in the absence of a maternal posterior organizer gene. Nature. 338, 629-632 (1989).
- Steinmann-Zwicky, M., Schmid, H., Nöthiger, R. Cell-autonomous and inductive signals can determine the sex of the germ line of Drosophila by regulating the gene Sxl. Cell. 57 (1), 157-166 (1989).
- Stein, D., Roth, S., Vogelsang, E., Nüsslein-Volhard, C. The polarity of the dorsoventral axis in the drosophila embryo is defined by an extracellular signal. Cell. 65 (5), 725-735 (1991).
- Kobayashi, S., Yamada, M., Asaoka, M., Kitamura, T. Essential role of the posterior morphogen nanos for germline development in Drosophila. Nature. 380, 708-711 (1996).
- Asaoka, M., et al. Offspring production from cryopreserved primordial germ cells in Drosophila. Comm Biol. 4 (1), 1159 (2021).
- Blitz, I. L., Fish, M. B., Cho, K. W. Y. Leapfrogging: primordial germ cell transplantation permits recovery of CRISPR/Cas9-induced mutations in essential genes. Development. 143 (15), 2868-2875 (2016).
- Koslová, A., et al. Precise CRISPR/Cas9 editing of the NHE1 gene renders chickens resistant to the J subgroup of avian leukosis virus. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (4), 2108-2112 (2020).
- Zhang, F. Efficient generation of zebrafish maternal-zygotic mutants through transplantation of ectopically induced and Cas9/gRNA targeted primordial germ cells. J Genet Genom. 47 (1), 37-47 (2020).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. Stages of Drosophila Embryogenesis. The Embryonic Development of Drosophila. , (1997).
- Manning, A. A sperm factor affecting the receptivity of Drosophila melanogaster females. Nature. 194, 252-253 (1962).
- Kubli, E. Sex-peptides: seminal peptides of the Drosophila male. Cell Mol Life Sci. 60, 1689-1704 (2003).
- Lehmann, R., Nüsslein-Volhard, C. Abdominal segmentation, pole cell formation, and embryonic polarity require the localized activity of oskar, a maternal gene in drosophila. Cell. 47 (1), 141-152 (1986).
- Kiger, A. A., Gigliotti, S., Fuller, M. T. Developmental genetics of the essential Drosophila Nucleoporin nup154: allelic differences due to an outward-directed promoter in the P-element 3′ end. Genética. 153 (2), 799-812 (1999).
- Rienzi, L. F., et al. Perspectives in gamete and embryo cryopreservation. Semin Reprod Med. 36 (5), 253-264 (2018).
