Primordiale cryopreservatie van kiemcellen en heropleving van Drosophila-stammen
Summary
Een langdurige conserveringsmethode voor Drosophila-stammen als alternatief voor de frequente overdracht van volwassen vliegen naar flesjes met vers voedsel is zeer wenselijk. Dit protocol beschrijft de cryopreservatie van Drosophila primordiale kiemcellen en de heropleving van stammen via hun transplantatie naar agametische gastheerembryo’s.
Abstract
Drosophila-stammen moeten in stand worden gehouden door de frequente overdracht van volwassen vliegen naar nieuwe injectieflacons. Dit brengt het gevaar met zich mee van mutatieverslechtering en fenotypische veranderingen. De ontwikkeling van een alternatieve methode voor langdurige bewaring zonder dergelijke veranderingen is daarom absoluut noodzakelijk. Ondanks eerdere succesvolle pogingen is cryopreservatie van Drosophila-embryo’s nog steeds niet van praktisch nut vanwege de lage reproduceerbaarheid. Hier beschrijven we een protocol voor cryopreservatie van primordiale kiemcellen (PGC) en stamopwekking via transplantatie van gecryopreserveerde PGC’s in agametische Drosophila melanogaster (D. melanogaster) gastheerembryo’s. PGC’s zijn zeer doorlaatbaar voor cryoprotectieve middelen (CPA’s), en ontwikkelings- en morfologische variatie tussen stammen is minder problematisch dan bij cryopreservatie van embryo’s. Bij deze methode worden PGC’s verzameld uit ongeveer 30 donorembryo’s, na CPA-behandeling in een naald geladen en vervolgens gecryopreserveerd in vloeibare stikstof. Om van donoren afgeleide gameten te produceren, worden de gecryopreserveerde PGC’s in een naald ontdooid en vervolgens gedeponeerd in ongeveer 15 agametische gastheerembryo’s. Met dit protocol werd een frequentie van ten minste 15% vruchtbare vliegen bereikt, en het aantal nakomelingen per vruchtbaar paar was altijd meer dan genoeg om de oorspronkelijke stam nieuw leven in te blazen (het gemiddelde aantal nakomelingen was 77,2 ± 7,1), wat wijst op het vermogen van gecryopreserveerde PGC’s om kiembaanstamcellen te worden. Het gemiddelde aantal vruchtbare vliegen per naald was 1,1 ± 0,2, en 9 van de 26 naalden produceerden twee of meer vruchtbare nakomelingen. Het bleek dat 11 naalden voldoende zijn om 6 of meer nakomelingen te produceren, waarin waarschijnlijk ten minste één vrouwtje en één mannetje zijn opgenomen. De agametische gastheer maakt het mogelijk om de soort snel nieuw leven in te blazen door simpelweg nieuw opgekomen vrouwelijke en mannelijke vliegen te kruisen. Bovendien hebben PGC’s het potentieel om te worden gebruikt in genetische manipulatietoepassingen, zoals genoombewerking.
Introduction
Het in stand houden van Drosophila-stammen door de overdracht van volwassen vliegen naar nieuwe voedselflesjes resulteert onvermijdelijk in de accumulatie van mutaties en epigenetische veranderingen in de loop van de tijd. De ontwikkeling van een alternatieve methode voor het langdurig in stand houden van Drosophila-stammen zonder dergelijke veranderingen is absoluut noodzakelijk, vooral voor referentiestammen waarin het hele genoom moet worden gehandhaafd. Er zijn verschillende succesvollepogingen beschreven om Drosophila-embryo’s of eierstokken te cryopreservatie 1,2,3. Helaas zijn ze nog steeds niet van praktisch nut vanwege de lage reproduceerbaarheid. Embryo’s in een vroeg stadium hebben inderdaad een laag overlevingspercentage na cryopreservatie vanwege hun hoge dooiergehalte, wat de permeatie en diffusie van cryoprotectieve middelen (CPA) belemmert 2,3. De CPA-permeabiliteit wordt ook ernstig beperkt door de wasachtige lagen van embryo’s in een laat stadium. Het is moeilijk en tijdrovend om een stamspecifieke tijdsperiode te vinden waarin embryo’s een hoge overlevingskans en een dunnere waslaag hebben. Onlangs hebben Zhan et al.4 methoden verbeterd voor embryopermeabilisatie, CPA-laden en vitrificatie en met succes gecryopreserveerde embryo’s van meerdere stammen. De methoden zijn echter niet gemakkelijk toe te passen omdat de levensvatbaarheid van embryo’s na permeabilisatie meestal slecht is. Daarom zijn verdere verbetering en ontwikkeling van alternatieve benaderingen nog steeds nodig. Methoden met cryopreservatie van primordiale kiemcellen (PGC’s) zijn een alternatieve benadering voor het langdurig in stand houden van Drosophila-stammen.
PGC-transplantatie (ook wel poolcel genoemd) is gebruikt om kiembaanchimaera’s te genereren, vooral vrouwtjes, om processen te bestuderen zoals maternale effecten van zygote letale mutaties en geslachtsbepaling van geslachtscellen 5,6,7,8,9,10,11,12 . PGC’s zijn veel kleiner dan embryo’s en zijn waarschijnlijk zeer doorlaatbaar voor de meeste cryoprotectanten. Bovendien is ontwikkelings- en morfologische variatie tussen stammen minder problematisch, en een agametische gastheer maakt snel herstel van hele genomen mogelijk. We hebben onlangs een nieuwe methode van PGC-cryopreservatie13 ontwikkeld, die de anders onvermijdelijke genetische en epigenetische veranderingen in Drosophila-stammen voorkomt. Hier presenteren we het gedetailleerde protocol.
Deze cryopreservatiemethode vereist specifieke expertise op het gebied van PGC-behandeling en -instrumentatie. Hoewel een stapsgewijze aanpak een efficiënte oplossing kan zijn voor degenen die er niet bekend mee zijn, kan het ongeschikt zijn voor kleine laboratoria vanwege instrumentatievereisten. Dit PGC-cryopreservatieprotocol kan gemakkelijker worden aangepast voor gebruik met verschillende Drosophila-soorten en verschillende insectensoorten dan cryopreservatieprotocollen voor embryo’s vanwege kleinere ontwikkelings- en morfologische verschillen. PGC’s kunnen mogelijk ook worden gebruikt in genetische manipulatietoepassingen, zoals genoombewerking 14,15,16. Samenvattend kan deze methode worden gebruikt in voorraadcentra en andere laboratoria om vliegen- en andere insectenstammen gedurende langere tijd zonder veranderingen in stand te houden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een kritische factor voor succes bij PGC-cryopreservatie en -opwekking is het gebruik van goede embryo’s. Jonge vrouwtjes (bijv. 3 tot 5 dagen oud) moeten worden gebruikt voor het verzamelen van embryo’s. Zowel donor- als gastheerembryo’s worden beoordeeld door middel van microscopische inspectie, en alleen die in het blastodermstadium (stadium 5) worden gebruikt12. Voor PGC-verzameling richten we meestal ongeveer 40 donorembryo’s uit in een periode van 20 minuten en verzamelen we PGC’s van ongeve…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken het KYOTO Drosophila Stock Center voor vliegenstammen. We danken ook mevrouw Wanda Miyata voor de Engelstalige redactie van het manuscript en Dr. Jeremy Allen van Edanz (https://jp.edanz.com/ac) voor het redigeren van een concept van dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door subsidies (JP16km0210072, JP17km0210146, JP18km0210146) van het Japan Agency for Medical Research and Development (AMED) aan T.T.-S.-K., subsidies (JP16km0210073, JP17km0210147, JP18km0210145) van AMED aan SK, een subsidie (JP20km0210172) van AMED aan T.T.-S.-K. en S.K., een Grant-in-Aid for Scientific Research (C) (JP19K06780) van de Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) aan T.T.-S.-K., en een Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (JP18H05552) van JSPS aan S.K.
Materials
| Acetic acid | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 017-00256 | For embryo collection |
| Agar powder | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 010-08725 | For embryo collection |
| Calcium chloride | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 038-24985 | For EBR solution |
| Capillary | Sutter Instrument | B100-75-10-PT | BOROSILICATE GLASS; O.D: 1.0mm, I.D: 0.75mm , length: 10cm, 225Pcs |
| Capillary holder | Eppendorf | 5196 081.005 | Capillary holder 4; for micromanipulation |
| Chromic acid mixture | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 037-05415 | For needle washing |
| CPA solution | 1x EBR containing 20% ethylene glycol and 1M sucrose | ||
| Double-sided tape | 3M | Scotch w-12 | For glue extracting |
| Ephrussi–Beadle Ringer solution (EBR) | 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, and 10 mM Hepes at pH 6.9 | ||
| Ethanol (99.5) | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 057-00451 | For embryo collection |
| Ethylene glycol | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 054-00983 | For CPA solution |
| Falcon 50 mm x 9 mm bacteriological petri dish | Corning Inc. | 351006 | For embryo collection |
| Forceps | Vigor | Type5 Titan | For embryo handling |
| Grape juice | Asahi Soft Drinks Co., LTD. | Welch's Grape 100 | For embryo collection |
| Grape juice agar plate | 50% grape juice, 2% agar, 1% ethanol, 1% acetic acid | ||
| Heptane | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 084-08105 | For glue extracting |
| Humidifier | APIX INTERNATIONAL CO., LTD. | FSWD2201-WH | For embryo preparation |
| Inverted microscope | Leica Microsystems GmbH | Leica DM IL LED | For micromanipulation |
| Luer-lock glass syringe | Tokyo Garasu Kikai Co., Ltd. | 0550 14 71 08 | Coat a plunger with silicon oil (FL-100-450CS);for micromanipulation |
| Mechanical micromanipulator | Leica Microsystems GmbH | For micromanipulation | |
| Micro slide glass | Matsunami Glass Ind., Ltd. | S-2441 | For embryo aligning |
| Microgrinder | NARISHIGE Group | Custom order | EG-401-S combined EG-401 and MF2 (with ocular lens MF2-LE15 ); for needle preparation |
| Microscope camera | Leica Microsystems GmbH | Leica MC170 HD | For micromanipulation |
| Needle holder | Merck KGaA | Eppendorf TransferTip (ES) | For cryopreservation |
| Potassium chloride | Nacalai Tesque, Inc. | 28514-75 | For EBR solution |
| Puller | NARISHIGE Group | PN-31 | For needle preparation; the heater level is set to 85.0-98.4, the magnet main level to 57.8, and the magnet sub level to 45.0. |
| PVC adhesive tape for electric insulation | Nitto Denko Corporation | J2515 | For embryo-pool frame |
| Silicon oil | Shin-Etsu Chemical, Co, Ltd. | FL-100-450CS | For embryo handling |
| Sodium chloride | Nacalai Tesque, Inc. | 31320-05 | For EBR solution |
| Sodium hypochlorite solution | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 197-02206 | Undiluted and freshly prepared; for embryo breaching |
| Sucrose | Nacalai Tesque, Inc. | 30404-45 | For CPA solution |
Referências
- Brüschweiler, W., Gehring, W. A method for freezing living ovaries of Drosophila melanogaster larvae and its application to the storage of mutant stocks. Experientia. 29, 134-135 (1973).
- Steponkus, P. L., et al. Cryopreservation of Drosophila melanogaster embryos. Nature. 345, 170-172 (1990).
- Mazur, P., Cole, K. W., Hall, J. W., Schreuders, P. D., Mahowald, A. P. Cryobiological preservation of Drosophila embryos. Science. 258 (5090), 1932-1935 (1992).
- Zhan, L., Li, M. G., Hays, T., Bischof, J. Cryopreservation method for Drosophila melanogaster embryos. Nat Comm. 12, 2412 (2021).
- Van Deusen, E. B. Sex determination in germ line chimeras of Drosophila melanogaster. Development. 37 (1), 173-185 (1977).
- Breen, T. R., Duncan, I. M. Maternal expression of genes that regulate the bithorax complex of Drosophila melanogaster. Dev Biol. 118, 442-456 (1986).
- Schupbach, T., Wieschaus, E. Germline autonomy of maternal-effect mutations altering the embryonic body pattern of Drosophila. Dev Biol. 113, 443-448 (1986).
- Irish, V., Lehmann, R., Akam, M. The Drosophila posterior-group gene nanos functions by repressing hunchback activity. Nature. 338, 646-648 (1989).
- Hülskamp, M., Schröder, C., Pfeifle, C., Jäckle, H., Tautz, D. Posterior segmentation of the Drosophila embryo in the absence of a maternal posterior organizer gene. Nature. 338, 629-632 (1989).
- Steinmann-Zwicky, M., Schmid, H., Nöthiger, R. Cell-autonomous and inductive signals can determine the sex of the germ line of Drosophila by regulating the gene Sxl. Cell. 57 (1), 157-166 (1989).
- Stein, D., Roth, S., Vogelsang, E., Nüsslein-Volhard, C. The polarity of the dorsoventral axis in the drosophila embryo is defined by an extracellular signal. Cell. 65 (5), 725-735 (1991).
- Kobayashi, S., Yamada, M., Asaoka, M., Kitamura, T. Essential role of the posterior morphogen nanos for germline development in Drosophila. Nature. 380, 708-711 (1996).
- Asaoka, M., et al. Offspring production from cryopreserved primordial germ cells in Drosophila. Comm Biol. 4 (1), 1159 (2021).
- Blitz, I. L., Fish, M. B., Cho, K. W. Y. Leapfrogging: primordial germ cell transplantation permits recovery of CRISPR/Cas9-induced mutations in essential genes. Development. 143 (15), 2868-2875 (2016).
- Koslová, A., et al. Precise CRISPR/Cas9 editing of the NHE1 gene renders chickens resistant to the J subgroup of avian leukosis virus. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (4), 2108-2112 (2020).
- Zhang, F. Efficient generation of zebrafish maternal-zygotic mutants through transplantation of ectopically induced and Cas9/gRNA targeted primordial germ cells. J Genet Genom. 47 (1), 37-47 (2020).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. Stages of Drosophila Embryogenesis. The Embryonic Development of Drosophila. , (1997).
- Manning, A. A sperm factor affecting the receptivity of Drosophila melanogaster females. Nature. 194, 252-253 (1962).
- Kubli, E. Sex-peptides: seminal peptides of the Drosophila male. Cell Mol Life Sci. 60, 1689-1704 (2003).
- Lehmann, R., Nüsslein-Volhard, C. Abdominal segmentation, pole cell formation, and embryonic polarity require the localized activity of oskar, a maternal gene in drosophila. Cell. 47 (1), 141-152 (1986).
- Kiger, A. A., Gigliotti, S., Fuller, M. T. Developmental genetics of the essential Drosophila Nucleoporin nup154: allelic differences due to an outward-directed promoter in the P-element 3′ end. Genética. 153 (2), 799-812 (1999).
- Rienzi, L. F., et al. Perspectives in gamete and embryo cryopreservation. Semin Reprod Med. 36 (5), 253-264 (2018).
