Cryoconservation des cellules germinales primordiales et renaissance des souches de drosophile
Summary
Il est hautement souhaitable de mettre au point une méthode de conservation à long terme des souches de drosophile comme solution de rechange au transfert fréquent de mouches adultes dans des flacons d’aliments frais. Ce protocole décrit la cryoconservation des cellules germinales primordiales de la drosophile et la renaissance de la souche via leur transplantation sur des embryons hôtes agamétiques.
Abstract
Les souches de drosophiles doivent être maintenues par le transfert fréquent de mouches adultes dans de nouveaux flacons. Cela comporte un risque de détérioration mutationnelle et de changements phénotypiques. Il est donc impératif de mettre au point une méthode alternative de conservation à long terme sans de tels changements. Malgré des tentatives antérieures réussies, la cryoconservation des embryons de drosophile n’est toujours pas d’une utilité pratique en raison de sa faible reproductibilité. Nous décrivons ici un protocole de cryoconservation des cellules germinales primordiales (PGC) et de reconstitution de souches par transplantation de PGC cryoconservés dans des embryons hôtes agamétiques de Drosophila melanogaster (D. melanogaster). Les PGC sont très perméables aux agents cryoprotecteurs (CPA), et les variations développementales et morphologiques entre les souches sont moins problématiques que dans la cryoconservation des embryons. Dans cette méthode, les PGC sont prélevés sur environ 30 embryons de donneurs, chargés dans une aiguille après le traitement CPA, puis cryoconservés dans de l’azote liquide. Pour produire des gamètes dérivés d’un donneur, les PGC cryoconservés dans une aiguille sont décongelés, puis déposés dans environ 15 embryons hôtes agamétiques. Une fréquence d’au moins 15 % de mouches fertiles a été atteinte avec ce protocole, et le nombre de descendants par couple fertile était toujours plus que suffisant pour faire revivre la souche originale (le nombre moyen de descendants étant de 77,2 ± 7,1), ce qui indique la capacité des PGC cryoconservés à devenir des cellules souches germinales. Le nombre moyen de mouches fertiles par aiguille était de 1,1 ± 0,2, et 9 aiguilles sur 26 ont produit deux ou plusieurs descendants fertiles. Il a été constaté que 11 aiguilles suffisent pour produire 6 descendants ou plus, dans lesquels au moins une femelle et un mâle sont probablement inclus. L’hôte agametique permet de faire revivre la souche rapidement en croisant simplement des mouches femelles et mâles nouvellement émergées. De plus, les PGC ont le potentiel d’être utilisés dans des applications de génie génétique, telles que l’édition du génome.
Introduction
Le maintien des souches de drosophile par le transfert de mouches adultes dans de nouveaux flacons de nourriture entraîne inévitablement l’accumulation de mutations et de changements épigénétiques au fil du temps. Il est impératif de mettre au point une méthode alternative pour le maintien à long terme des souches de drosophile sans de tels changements, en particulier pour les souches de référence dans lesquelles l’ensemble du génome doit être maintenu. Plusieurs tentatives réussies de cryoconservation d’embryons ou d’ovaires de drosophiles ont été décrites 1,2,3. Malheureusement, ils ne sont toujours pas d’une utilité pratique en raison de leur faible reproductibilité. En effet, les embryons à un stade précoce ont un faible taux de survie après cryoconservation en raison de leur forte teneur en vitellus, ce qui empêche la perméation et la diffusion de l’agent cryoprotecteur (CPA) 2,3. La perméabilité au CPA est également sévèrement limitée par les couches cireuses des embryons à un stade avancé. Il est difficile et prend beaucoup de temps de trouver une période spécifique à la souche au cours de laquelle les embryons ont un taux de survie élevé et une couche de cire plus fine. Récemment, Zhan et al.4 ont amélioré les méthodes de perméabilisation des embryons, de chargement de CPA et de vitrification et ont cryoconservé avec succès des embryons de plusieurs souches. Cependant, les méthodes ne sont pas faciles à appliquer car la viabilité des embryons après perméabilisation a tendance à être faible. Par conséquent, il est encore nécessaire d’améliorer et de développer des approches alternatives. Les méthodes de cryoconservation des cellules germinales primordiales (PGC) constituent une approche alternative pour le maintien à long terme des souches de drosophile.
La transplantation de PGC (également appelée cellule polaire) a été utilisée pour générer des chimères germinales, en particulier des femelles, afin d’étudier des processus tels que les effets maternels des mutations létales zygotiques et la détermination du sexe des cellules germinales 5,6,7,8,9,10,11,12 . Les PGC sont beaucoup plus petits que les embryons et sont susceptibles d’être très perméables à la plupart des cryoprotecteurs. De plus, la variation développementale et morphologique entre les souches est moins problématique, et un hôte agametique permet une restauration rapide de génomes entiers. Nous avons récemment mis au point une nouvelle méthode de cryoconservation PGC13, qui empêche les changements génétiques et épigénétiques autrement inévitables dans les souches de drosophile. Nous vous présentons ici le protocole détaillé.
Cette méthode de cryoconservation nécessite une expertise spécifique dans la manipulation et l’instrumentation des PGC. Bien qu’une approche étape par étape puisse être une solution efficace pour ceux qui ne la connaissent pas, elle peut ne pas convenir aux petits laboratoires en raison des exigences en matière d’instrumentation. Ce protocole de cryoconservation PGC peut être plus facilement adapté pour être utilisé avec différentes espèces de drosophiles et différentes espèces d’insectes que les protocoles de cryoconservation d’embryons en raison de différences de développement et morphologiques plus faibles. Les PGC peuvent également être utilisés dans des applications de génie génétique, telles que l’édition du génome 14,15,16. En résumé, cette méthode peut être utilisée dans les centres de stockage et autres laboratoires pour maintenir les souches de mouches et d’autres insectes pendant des périodes prolongées sans changements.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un facteur essentiel pour le succès de la cryoconservation et de la renaissance des PGC est d’utiliser de bons embryons. Les jeunes femelles (p. ex., âgées de 3 à 5 jours) doivent être utilisées pour le prélèvement d’embryons. Les embryons du donneur et de l’hôte sont évalués par inspection microscopique, et seuls ceux au stade du blastoderme (stade 5) sont utilisés12. Pour le prélèvement de PGC, nous alignons généralement environ 40 embryons de donneurs sur une période de 2…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le KYOTO Drosophila Stock Center pour les souches de mouches. Nous remercions également Mme Wanda Miyata pour l’édition en anglais du manuscrit et le Dr Jeremy Allen d’Edanz (https://jp.edanz.com/ac) pour l’édition d’une ébauche de ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par des subventions (JP16km0210072, JP17km0210146, JP18km0210146) de l’Agence japonaise pour la recherche et le développement médicaux (AMED) à T.T.-S.-K., des subventions (JP16km0210073, JP17km0210147, JP18km0210145) d’AMED à S.K., une subvention (JP20km0210172) d’AMED à T.T.-S.-K. et S.K., une subvention d’aide à la recherche scientifique (C) (JP19K06780) de la Société japonaise pour la promotion de la science (JSPS) à T.T.-S.-K., et une subvention d’aide à la recherche scientifique dans des domaines innovants (JP18H05552) de JSPS à S.K.
Materials
| Acetic acid | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 017-00256 | For embryo collection |
| Agar powder | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 010-08725 | For embryo collection |
| Calcium chloride | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 038-24985 | For EBR solution |
| Capillary | Sutter Instrument | B100-75-10-PT | BOROSILICATE GLASS; O.D: 1.0mm, I.D: 0.75mm , length: 10cm, 225Pcs |
| Capillary holder | Eppendorf | 5196 081.005 | Capillary holder 4; for micromanipulation |
| Chromic acid mixture | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 037-05415 | For needle washing |
| CPA solution | 1x EBR containing 20% ethylene glycol and 1M sucrose | ||
| Double-sided tape | 3M | Scotch w-12 | For glue extracting |
| Ephrussi–Beadle Ringer solution (EBR) | 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, and 10 mM Hepes at pH 6.9 | ||
| Ethanol (99.5) | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 057-00451 | For embryo collection |
| Ethylene glycol | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 054-00983 | For CPA solution |
| Falcon 50 mm x 9 mm bacteriological petri dish | Corning Inc. | 351006 | For embryo collection |
| Forceps | Vigor | Type5 Titan | For embryo handling |
| Grape juice | Asahi Soft Drinks Co., LTD. | Welch's Grape 100 | For embryo collection |
| Grape juice agar plate | 50% grape juice, 2% agar, 1% ethanol, 1% acetic acid | ||
| Heptane | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 084-08105 | For glue extracting |
| Humidifier | APIX INTERNATIONAL CO., LTD. | FSWD2201-WH | For embryo preparation |
| Inverted microscope | Leica Microsystems GmbH | Leica DM IL LED | For micromanipulation |
| Luer-lock glass syringe | Tokyo Garasu Kikai Co., Ltd. | 0550 14 71 08 | Coat a plunger with silicon oil (FL-100-450CS);for micromanipulation |
| Mechanical micromanipulator | Leica Microsystems GmbH | For micromanipulation | |
| Micro slide glass | Matsunami Glass Ind., Ltd. | S-2441 | For embryo aligning |
| Microgrinder | NARISHIGE Group | Custom order | EG-401-S combined EG-401 and MF2 (with ocular lens MF2-LE15 ); for needle preparation |
| Microscope camera | Leica Microsystems GmbH | Leica MC170 HD | For micromanipulation |
| Needle holder | Merck KGaA | Eppendorf TransferTip (ES) | For cryopreservation |
| Potassium chloride | Nacalai Tesque, Inc. | 28514-75 | For EBR solution |
| Puller | NARISHIGE Group | PN-31 | For needle preparation; the heater level is set to 85.0-98.4, the magnet main level to 57.8, and the magnet sub level to 45.0. |
| PVC adhesive tape for electric insulation | Nitto Denko Corporation | J2515 | For embryo-pool frame |
| Silicon oil | Shin-Etsu Chemical, Co, Ltd. | FL-100-450CS | For embryo handling |
| Sodium chloride | Nacalai Tesque, Inc. | 31320-05 | For EBR solution |
| Sodium hypochlorite solution | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 197-02206 | Undiluted and freshly prepared; for embryo breaching |
| Sucrose | Nacalai Tesque, Inc. | 30404-45 | For CPA solution |
Referências
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