Kryokonservierung von Primordialen Keimzellen und Wiederbelebung von Drosophila-Stämmen
Summary
Eine Langzeitkonservierungsmethode für Drosophila-Stämme als Alternative zum häufigen Umtopfen von adulten Fliegen in frische Fläschchen ist sehr wünschenswert. Dieses Protokoll beschreibt die Kryokonservierung von Drosophila-Urkeimzellen und die Wiederbelebung von Stämmen durch ihre Transplantation in agametische Wirtsembryonen.
Abstract
Drosophila-Stämme müssen durch häufiges Umfüllen von erwachsenen Fliegen in neue Fläschchen erhalten werden. Dies birgt die Gefahr einer Mutationsverschlechterung und phänotypischer Veränderungen. Die Entwicklung einer alternativen Methode zur Langzeitkonservierung ohne solche Änderungen ist daher zwingend erforderlich. Trotz früherer erfolgreicher Versuche ist die Kryokonservierung von Drosophila-Embryonen aufgrund der geringen Reproduzierbarkeit immer noch nicht von praktischem Nutzen. In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll für die Kryokonservierung von primordialen Keimzellen (PGC) und die Wiederbelebung von Stämmen durch Transplantation von kryokonservierten PGCs in agametische Wirtsembryonen von Drosophila melanogaster (D. melanogaster). PGCs sind sehr durchlässig für Kryoprotektiva (CPAs), und die entwicklungsbedingte und morphologische Variation zwischen den Stämmen ist weniger problematisch als bei der Kryokonservierung von Embryonen. Bei dieser Methode werden PGCs von etwa 30 Spenderembryonen entnommen, nach der CPA-Behandlung in eine Nadel geladen und dann in flüssigem Stickstoff kryokonserviert. Um Keimzellen aus Spendern herzustellen, werden die kryokonservierten PGCs in einer Nadel aufgetaut und dann in etwa 15 agametische Wirtsembryonen eingebracht. Mit diesem Protokoll wurde eine Häufigkeit von mindestens 15 % fruchtbarer Fliegen erreicht, und die Anzahl der Nachkommen pro fruchtbarem Paar war immer mehr als ausreichend, um den ursprünglichen Stamm wiederzubeleben (die durchschnittliche Nachkommenzahl betrug 77,2 ± 7,1), was auf die Fähigkeit kryokonservierter PGCs hinweist, sich in Keimbahnstammzellen zu verwandeln. Die durchschnittliche Anzahl der fruchtbaren Fliegen pro Nadel betrug 1,1 ± 0,2, und 9 von 26 Nadeln brachten zwei oder mehr fruchtbare Nachkommen hervor. Es wurde festgestellt, dass 11 Nadeln ausreichen, um 6 oder mehr Nachkommen zu produzieren, in denen wahrscheinlich mindestens ein Weibchen und ein Männchen enthalten sind. Der agametische Wirt ermöglicht es, den Stamm schnell wiederzubeleben, indem er einfach neu geschlüpfte weibliche und männliche Fliegen kreuzt. Darüber hinaus haben PGCs das Potenzial, in gentechnischen Anwendungen, wie z. B. der Genom-Editierung, eingesetzt zu werden.
Introduction
Die Aufrechterhaltung von Drosophila-Stämmen durch den Transfer erwachsener Fliegen in neue Futterfläschchen führt unweigerlich zur Anhäufung von Mutationen und epigenetischen Veränderungen im Laufe der Zeit. Die Entwicklung einer alternativen Methode zur langfristigen Erhaltung von Drosophila-Stämmen ohne solche Veränderungen ist unerlässlich, insbesondere für Referenzstämme, bei denen das gesamte Genom erhalten bleiben muss. Es wurden mehrere erfolgreiche Versuche zur Kryokonservierung von Drosophila-Embryonen oder -Eierstöcken beschrieben 1,2,3. Leider sind sie aufgrund der geringen Reproduzierbarkeit immer noch nicht von praktischem Nutzen. In der Tat haben Embryonen im Frühstadium aufgrund ihres hohen Dottergehalts, der die Permeation und Diffusion von Kryoprotektiva (CPA) behindert, eine niedrige Überlebensrate nach der Kryokonservierung 2,3. Die CPA-Permeabilität ist auch durch die wachsartigen Schichten von Embryonen im Spätstadium stark eingeschränkt. Es ist schwierig und zeitaufwändig, einen stammspezifischen Zeitraum zu finden, in dem Embryonen eine hohe Überlebensrate und eine dünnere Wachsschicht aufweisen. Kürzlich haben Zhan et al.4 die Methoden zur Permeabilisierung von Embryonen, zur CPA-Beladung und zur Vitrifikation verbessert und erfolgreich Embryonen mehrerer Stämme kryokonserviert. Die Methoden sind jedoch nicht einfach anzuwenden, da die Lebensfähigkeit der Embryonen nach der Permeabilisierung tendenziell schlecht ist. Daher sind weitere Verbesserungen und die Entwicklung alternativer Ansätze erforderlich. Methoden zur Kryokonservierung von primordialen Keimzellen (PGCs) sind ein alternativer Ansatz für die langfristige Erhaltung von Drosophila-Stämmen.
Die PGC-Transplantation (auch Polzelltransplantation genannt) wurde zur Erzeugung von Keimbahnchimären, insbesondere von Weibchen, verwendet, um Prozesse wie die mütterlichen Auswirkungen von zygotischen letalen Mutationen und die Geschlechtsbestimmung von Keimzellen zu untersuchen 5,6,7,8,9,10,11,12 . PGCs sind viel kleiner als Embryonen und wahrscheinlich sehr durchlässig für die meisten Kryoprotektiva. Darüber hinaus ist die entwicklungsbedingte und morphologische Variation zwischen den Stämmen weniger problematisch, und ein agametischer Wirt ermöglicht eine schnelle Wiederherstellung ganzer Genome. Wir haben kürzlich eine neue Methode der PGC-Kryokonservierung13 entwickelt, die die sonst unvermeidlichen genetischen und epigenetischen Veränderungen bei Drosophila-Stämmen verhindert. Hier stellen wir Ihnen das detaillierte Protokoll vor.
Diese Kryokonservierungsmethode erfordert spezifisches Fachwissen in der Handhabung und Instrumentierung von PGC. Während ein schrittweiser Ansatz für diejenigen, die damit nicht vertraut sind, eine effiziente Lösung sein kann, kann er für kleine Labore aufgrund der Anforderungen an die Instrumentierung ungeeignet sein. Dieses PGC-Kryokonservierungsprotokoll kann aufgrund geringerer Entwicklungs- und morphologischer Unterschiede leichter für die Verwendung mit verschiedenen Drosophila-Arten und verschiedenen Insektenarten angepasst werden als Embryo-Kryokonservierungsprotokolle. PGCs können möglicherweise auch in gentechnischen Anwendungen eingesetzt werden, wie z. B. bei der Genom-Editierung 14,15,16. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Methode in Lagerzentren und anderen Laboratorien eingesetzt werden kann, um Fliegen- und andere Insektenstämme über längere Zeiträume ohne Veränderungen zu erhalten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ein entscheidender Faktor für den Erfolg der PGC-Kryokonservierung und -Wiederbelebung ist die Verwendung guter Embryonen. Junge Weibchen (z. B. 3 bis 5 Tage alt) sollten für die Embryonenentnahme verwendet werden. Sowohl Spender- als auch Wirtsembryonen werden durch mikroskopische Inspektion beurteilt, und es werden nur solche im Blastodermstadium (Stadium 5) verwendet12. Für die PGC-Entnahme richten wir in der Regel ca. 40 Spenderembryonen in einem Zeitraum von 20 Minuten aus und entnehmen PG…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken dem KYOTO Drosophila Stock Center für die Fliegenstämme. Wir danken auch Frau Wanda Miyata für das englischsprachige Lektorat des Manuskripts und Dr. Jeremy Allen von Edanz (https://jp.edanz.com/ac) für die Bearbeitung eines Entwurfs dieses Manuskripts. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse (JP16km0210072, JP17km0210146, JP18km0210146) der Japan Agency for Medical Research and Development (AMED) an T.T.-S.-K., Zuschüsse (JP16km0210073, JP17km0210147, JP18km0210145) von AMED an S.K., einen Zuschuss (JP20km0210172) von AMED an T.T.-S.-K. und S.K., ein Grant-in-Aid for Scientific Research (C) (JP19K06780) von der Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) an T.T.-S.-K. und ein Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (JP18H05552) von JSPS an S.K.
Materials
| Acetic acid | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 017-00256 | For embryo collection |
| Agar powder | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 010-08725 | For embryo collection |
| Calcium chloride | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 038-24985 | For EBR solution |
| Capillary | Sutter Instrument | B100-75-10-PT | BOROSILICATE GLASS; O.D: 1.0mm, I.D: 0.75mm , length: 10cm, 225Pcs |
| Capillary holder | Eppendorf | 5196 081.005 | Capillary holder 4; for micromanipulation |
| Chromic acid mixture | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 037-05415 | For needle washing |
| CPA solution | 1x EBR containing 20% ethylene glycol and 1M sucrose | ||
| Double-sided tape | 3M | Scotch w-12 | For glue extracting |
| Ephrussi–Beadle Ringer solution (EBR) | 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, and 10 mM Hepes at pH 6.9 | ||
| Ethanol (99.5) | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 057-00451 | For embryo collection |
| Ethylene glycol | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 054-00983 | For CPA solution |
| Falcon 50 mm x 9 mm bacteriological petri dish | Corning Inc. | 351006 | For embryo collection |
| Forceps | Vigor | Type5 Titan | For embryo handling |
| Grape juice | Asahi Soft Drinks Co., LTD. | Welch's Grape 100 | For embryo collection |
| Grape juice agar plate | 50% grape juice, 2% agar, 1% ethanol, 1% acetic acid | ||
| Heptane | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 084-08105 | For glue extracting |
| Humidifier | APIX INTERNATIONAL CO., LTD. | FSWD2201-WH | For embryo preparation |
| Inverted microscope | Leica Microsystems GmbH | Leica DM IL LED | For micromanipulation |
| Luer-lock glass syringe | Tokyo Garasu Kikai Co., Ltd. | 0550 14 71 08 | Coat a plunger with silicon oil (FL-100-450CS);for micromanipulation |
| Mechanical micromanipulator | Leica Microsystems GmbH | For micromanipulation | |
| Micro slide glass | Matsunami Glass Ind., Ltd. | S-2441 | For embryo aligning |
| Microgrinder | NARISHIGE Group | Custom order | EG-401-S combined EG-401 and MF2 (with ocular lens MF2-LE15 ); for needle preparation |
| Microscope camera | Leica Microsystems GmbH | Leica MC170 HD | For micromanipulation |
| Needle holder | Merck KGaA | Eppendorf TransferTip (ES) | For cryopreservation |
| Potassium chloride | Nacalai Tesque, Inc. | 28514-75 | For EBR solution |
| Puller | NARISHIGE Group | PN-31 | For needle preparation; the heater level is set to 85.0-98.4, the magnet main level to 57.8, and the magnet sub level to 45.0. |
| PVC adhesive tape for electric insulation | Nitto Denko Corporation | J2515 | For embryo-pool frame |
| Silicon oil | Shin-Etsu Chemical, Co, Ltd. | FL-100-450CS | For embryo handling |
| Sodium chloride | Nacalai Tesque, Inc. | 31320-05 | For EBR solution |
| Sodium hypochlorite solution | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 197-02206 | Undiluted and freshly prepared; for embryo breaching |
| Sucrose | Nacalai Tesque, Inc. | 30404-45 | For CPA solution |
Referências
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