ショウ ジョウバエ 株の原始生殖細胞凍結保存と復活
Summary
ショウ ジョウバエ 株の長期保存方法は、成虫のハエの生鮮食品バイアルへの頻繁な移送の代替として非常に望ましい。このプロトコルはショウ ジョウバエ の原始生殖細胞のcryopreagingを記述し、agametic宿主の胚への移植によって緊張の復活。
Abstract
ショウジョウバエ 株は、成虫のハエを新しいバイアルに頻繁に移すことによって維持されなければなりません。これは、突然変異の悪化や表現型の変化の危険性を伴います。したがって、そのような変更を伴わない長期保存のための代替方法の開発が不可欠です。ショウ ジョウバエ 胚の凍結保存は、これまでの成功例にもかかわらず、再現性が低いため、まだ実用化されていません。ここでは、原始生殖細胞(PGC)の凍結保存と、無ガメティック ショウジョウバエ (D. melanogaster)宿主胚への凍結保存PGCの移植による株復活のプロトコルについて説明します。PGCは凍結保護剤(CPA)に対する透過性が高く、菌株間の発生的および形態学的変異は、胚凍結保存よりも問題が少ない。この方法では、約30個のドナー胚からPGCを採取し、CPA処理後にニードルに装填した後、液体窒素で凍結保存します。ドナー由来の配偶子を作製するには、針状に凍結保存されたPGCを解凍し、約15個の無配偶性宿主胚に沈着させます。このプロトコルでは、少なくとも15%の繁殖力のあるハエの頻度が達成され、受胎可能なカップルあたりの子孫の数は、常に元の株を復活させるのに十分すぎるほどであり(平均子孫数は77.2±7.1)、凍結保存されたPGCが生殖細胞幹細胞になる能力を示しています。針1本当たりの繁殖可能なハエの平均数は1.1±0.2であり、26本の針のうち9本が2つ以上の繁殖可能な子孫を産んだ。11本の針で6匹以上の子孫を産むことができ、少なくとも1匹の雌と1匹の雄が含まれている可能性が高いことがわかった。無ガメティック宿主は、新しく出現した雌と雄のハエを交配するだけで、株を迅速に復活させることができます。さらに、PGCはゲノム編集などの遺伝子工学的応用にも利用できる可能性があります。
Introduction
成虫のハエを新しい食用バイアルに移すことによるショウジョウバエ株の維持は、必然的に時間の経過とともに突然変異とエピジェネティックな変化の蓄積をもたらします。このような変化を伴わないショウジョウバエ株の長期維持のための代替法の開発は、特に全ゲノムを維持しなければならない参照株にとって不可欠である。ショウジョウバエの胚または卵巣を凍結保存するいくつかの成功した試みが報告されています1,2,3。残念ながら、再現性が低いため、まだ実用化されていません。実際、初期段階の胚は卵黄含有量が高いため、凍結保存後の生存率が低く、凍結保護剤(CPA)の浸透と拡散が妨げられます2,3。CPAの透過性は、後期胚のワックス状の層によっても厳しく制限されます。胚の生存率が高く、ワックス層が薄い菌株特異的な期間を見つけることは困難で時間がかかります。最近、Zhanら4は、胚の透過処理、CPAローディング、およびガラス化の方法を改善し、複数の株の胚の凍結保存に成功しました。しかし、透過処理後の胚の生存率が悪くなる傾向があるため、適用は容易ではありません。したがって、代替アプローチのさらなる改善と開発が依然として必要です。始原生殖細胞(PGC)の凍結保存を含む方法は、ショウジョウバエ株の長期維持のための代替アプローチです。
PGC(極細胞とも呼ばれる)移植は、接合性致死突然変異の母体への影響や生殖細胞の性決定などのプロセスを研究するために、生殖細胞キメラ、特に女性を生成するために使用されてきました5,6,7,8,9,10,11,12 .PGCは胚よりもはるかに小さく、ほとんどの凍結保護剤に対して高い透過性を持つ可能性があります。さらに、菌株間の発生的および形態学的変異は問題が少なく、非ガメティック宿主は全ゲノムの迅速な復元を可能にします。私たちは最近、ショウジョウバエ株の避けられない遺伝的およびエピジェネティックな変化を防ぐPGC凍結保存13の新しい方法を開発しました。ここでは、詳細なプロトコルを紹介します。
この凍結保存法には、PGCの取り扱いと装置に関する特別な専門知識が必要です。ステップバイステップのアプローチは、不慣れな人にとっては効率的なソリューションかもしれませんが、機器の要件により、小規模なラボには適さない場合があります。このPGC凍結保存プロトコルは、発生および形態学的の違いが小さいため、胚凍結保存プロトコルよりも異なるショウジョウバエ種および異なる昆虫種での使用により簡単に適応できます。PGCは、ゲノム編集14,15,16などの遺伝子工学的応用にも使用できる可能性がある。要約すると、この方法は、ストックセンターやその他の研究所で、ハエやその他の昆虫株を変化させることなく長期間維持するために使用できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
PGCの凍結保存と蘇生を成功させるための重要な要素は、良質な胚を使用することです。若い女性(例:.、3〜5日齢)は、胚の収集に使用する必要があります。ドナー胚と宿主胚の両方が顕微鏡検査によって評価され、胚盤葉段階(ステージ5)の胚のみが使用されます12。PGCの採取では、通常、20分間に約40個のドナー胚をアライメントし、初期段階5で約30個の胚からPGCを採取します?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
KYOTO Drosophila Stock Centerのハエ株に感謝します。また、原稿の英文校正をしてくださった宮田ワンダさんと、この原稿の草稿を編集してくださったエダンツ(https://jp.edanz.com/ac)のジェレミー・アレン博士にも感謝します。本研究は、国立研究開発法人日本医療研究開発機構(AMED)から東京証券取引所への助成金(JP16km0210072、JP17km0210146、JP18km0210146)、AMEDから株式会社への助成金(JP16km0210073、JP17km0210147、JP18km0210145)、AMEDから台湾株式会社への助成金(JP20km0210172)の支援を受けて行われました。日本学術振興会(JSPS)からT.T.S.-K.への基盤研究(C)(JP19K06780)および日本学術振興会からS.K.への新学術領域研究(JP18H05552)です。
Materials
| Acetic acid | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 017-00256 | For embryo collection |
| Agar powder | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 010-08725 | For embryo collection |
| Calcium chloride | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 038-24985 | For EBR solution |
| Capillary | Sutter Instrument | B100-75-10-PT | BOROSILICATE GLASS; O.D: 1.0mm, I.D: 0.75mm , length: 10cm, 225Pcs |
| Capillary holder | Eppendorf | 5196 081.005 | Capillary holder 4; for micromanipulation |
| Chromic acid mixture | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 037-05415 | For needle washing |
| CPA solution | 1x EBR containing 20% ethylene glycol and 1M sucrose | ||
| Double-sided tape | 3M | Scotch w-12 | For glue extracting |
| Ephrussi–Beadle Ringer solution (EBR) | 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, and 10 mM Hepes at pH 6.9 | ||
| Ethanol (99.5) | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 057-00451 | For embryo collection |
| Ethylene glycol | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 054-00983 | For CPA solution |
| Falcon 50 mm x 9 mm bacteriological petri dish | Corning Inc. | 351006 | For embryo collection |
| Forceps | Vigor | Type5 Titan | For embryo handling |
| Grape juice | Asahi Soft Drinks Co., LTD. | Welch's Grape 100 | For embryo collection |
| Grape juice agar plate | 50% grape juice, 2% agar, 1% ethanol, 1% acetic acid | ||
| Heptane | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 084-08105 | For glue extracting |
| Humidifier | APIX INTERNATIONAL CO., LTD. | FSWD2201-WH | For embryo preparation |
| Inverted microscope | Leica Microsystems GmbH | Leica DM IL LED | For micromanipulation |
| Luer-lock glass syringe | Tokyo Garasu Kikai Co., Ltd. | 0550 14 71 08 | Coat a plunger with silicon oil (FL-100-450CS);for micromanipulation |
| Mechanical micromanipulator | Leica Microsystems GmbH | For micromanipulation | |
| Micro slide glass | Matsunami Glass Ind., Ltd. | S-2441 | For embryo aligning |
| Microgrinder | NARISHIGE Group | Custom order | EG-401-S combined EG-401 and MF2 (with ocular lens MF2-LE15 ); for needle preparation |
| Microscope camera | Leica Microsystems GmbH | Leica MC170 HD | For micromanipulation |
| Needle holder | Merck KGaA | Eppendorf TransferTip (ES) | For cryopreservation |
| Potassium chloride | Nacalai Tesque, Inc. | 28514-75 | For EBR solution |
| Puller | NARISHIGE Group | PN-31 | For needle preparation; the heater level is set to 85.0-98.4, the magnet main level to 57.8, and the magnet sub level to 45.0. |
| PVC adhesive tape for electric insulation | Nitto Denko Corporation | J2515 | For embryo-pool frame |
| Silicon oil | Shin-Etsu Chemical, Co, Ltd. | FL-100-450CS | For embryo handling |
| Sodium chloride | Nacalai Tesque, Inc. | 31320-05 | For EBR solution |
| Sodium hypochlorite solution | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 197-02206 | Undiluted and freshly prepared; for embryo breaching |
| Sucrose | Nacalai Tesque, Inc. | 30404-45 | For CPA solution |
Referências
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