Primordial kimcellekryopreservering og gjenoppliving av Drosophila-stammer
Summary
En langsiktig konserveringsmetode for Drosophila-stammer som et alternativ til hyppig overføring av voksne fluer til ferske matflasker er svært ønskelig. Denne protokollen beskriver kryopreservering av Drosophila primordiale kimceller og stammegjenoppliving via transplantasjon til agametiske vertsembryoer.
Abstract
Drosophila-stammer må opprettholdes ved hyppig overføring av voksne fluer til nye hetteglass. Dette medfører fare for mutasjonsforringelse og fenotypiske forandringer. Utvikling av en alternativ metode for langtidsbevaring uten slike endringer er derfor avgjørende. Til tross for tidligere vellykkede forsøk, er kryopreservering av Drosophila-embryoer fortsatt ikke av praktisk nytte på grunn av lav reproduserbarhet. Her beskriver vi en protokoll for primordial kimcelle (PGC) kryopreservering og stammegjenoppliving via transplantasjon av kryopreserverte PGC til agametiske Drosophila melanogaster (D. melanogaster) vertsembryoer. PGC er svært gjennomtrengelige for kryobeskyttende midler (CPA), og utviklingsmessig og morfologisk variasjon mellom stammer er mindre problematisk enn ved embryokryopreservering. I denne metoden samles PGC fra ca. 30 donorembryoer, lastes inn i en nål etter CPA-behandling, og deretter kryopreserveres i flytende nitrogen. For å produsere donoravledede kjønnsceller, tines de kryopreserverte PGCene i en nål og deponeres deretter i ca. 15 agametiske vertsembryoer. En frekvens på minst 15% fruktbare fluer ble oppnådd med denne protokollen, og antall avkom per fruktbart par var alltid mer enn nok til å gjenopplive den opprinnelige stammen (gjennomsnittlig avkomstall er 77,2 ± 7,1), noe som indikerer evnen til kryopreserverte PGCer til å bli kimlinjestamceller. Gjennomsnittlig antall fertile fluer per nål var 1,1 ± 0,2, og 9 av 26 nåler produserte to eller flere fruktbare avkom. Det ble funnet at 11 nåler er nok til å produsere 6 eller flere avkom, hvor minst en kvinne og en hann sannsynligvis er inkludert. Den agametiske verten gjør det mulig å gjenopplive stammen raskt ved ganske enkelt å krysse nyoppståtte kvinnelige og mannlige fluer. I tillegg har PGC potensial til å bli brukt i genteknologiske applikasjoner, for eksempel genomredigering.
Introduction
Vedlikehold av Drosophila-stammer ved overføring av voksne fluer til nye matflasker resulterer uunngåelig i akkumulering av mutasjoner og epigenetiske endringer over tid. Utvikling av en alternativ metode for langsiktig vedlikehold av Drosophila-stammer uten slike endringer er avgjørende, spesielt for referansestammer der hele genomet må opprettholdes. Flere vellykkede forsøk på å kryobevare Drosophila-embryoer eller eggstokker har blitt beskrevet 1,2,3. Dessverre er de fortsatt ikke av praktisk bruk på grunn av lav reproduserbarhet. Faktisk har embryoer i tidlig stadium en lav overlevelsesrate etter kryopreservering på grunn av deres høye eggeplommeinnhold, noe som hindrer kryobeskyttende middel (CPA) permeasjon og diffusjon 2,3. CPA permeabilitet er også sterkt begrenset av voksagtige lag av sent stadium embryoer. Det er vanskelig og tidkrevende å finne en stammespesifikk tidsperiode der embryoer har høy overlevelse og et tynnere vokslag. Nylig forbedret Zhan et al.4 metoder for embryopermeabilisering, CPA-belastning og vitrifikasjon og vellykket kryopreserverte embryoer av flere stammer. Metodene er imidlertid ikke enkle å anvende fordi levedyktigheten til embryoer etter permeabilisering har en tendens til å være dårlig. Derfor er det fortsatt behov for ytterligere forbedring og utvikling av alternative tilnærminger. Metoder som involverer kryopreservering av primordiale kimceller (PGC) er en alternativ tilnærming for langsiktig vedlikehold av Drosophila-stammer.
PGC (også kalt polcelle) transplantasjon har blitt brukt til å generere germline kimærer, spesielt kvinner, for å studere prosesser som mors effekter av zygotiske dødelige mutasjoner og kjønnsbestemmelse av kjønnsceller 5,6,7,8,9,10,11,12 . PGC er mye mindre enn embryoer og vil sannsynligvis være svært gjennomtrengelig for de fleste kryobeskyttelsesmidler. Videre er utviklingsmessig og morfologisk variasjon mellom stammer mindre problematisk, og en agametisk vert muliggjør rask restaurering av hele genomer. Vi har nylig utviklet en ny metode for PGC kryopreservering13, som forhindrer de ellers uunngåelige genetiske og epigenetiske endringene i Drosophila-stammer. Her presenterer vi den detaljerte protokollen.
Denne kryopreserveringsmetoden krever spesifikk ekspertise innen PGC-håndtering og instrumentering. Mens en trinnvis tilnærming kan være en effektiv løsning for de som ikke er kjent med det, kan det være uegnet for små laboratorier på grunn av instrumenteringskrav. Denne PGC-kryopreserveringsprotokollen kan lettere tilpasses for bruk med forskjellige Drosophila-arter og forskjellige insektarter enn embryokryopreserveringsprotokoller på grunn av mindre utviklingsmessige og morfologiske forskjeller. PGC kan også potensielt brukes i genteknologiske applikasjoner, for eksempel genomredigering 14,15,16. Oppsummert kan denne metoden brukes i lagersentre og andre laboratorier for å opprettholde flue- og andre insektstammer i lengre perioder uten endringer.
Protocol
Representative Results
Discussion
En kritisk faktor for suksess i PGC kryopreservering og vekkelse er å bruke gode embryoer. Unge hunner (f.eks. 3 til 5 dager gamle) bør brukes til embryoinnsamling. Både donor- og vertsembryoer vurderes ved mikroskopisk inspeksjon, og bare de på blastodermstadiet (trinn 5) brukes12. For PGC-innsamling justerer vi vanligvis ca. 40 donorembryoer i løpet av en periode på 20 minutter og samler PGC fra ca. 30 embryoer tidlig i fase 5; Eldre og defekte embryoer brukes ikke. Etter kryopreservering …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker KYOTO Drosophila Stock Center for fluestammer. Vi takker også Wanda Miyata for engelskspråklig redigering av manuskriptet og Dr. Jeremy Allen fra Edanz (https://jp.edanz.com/ac) for redigering av et utkast til dette manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd (JP16km0210072, JP17km0210146, JP18km0210146) fra Japan Agency for Medical Research and Development (AMED) til T.T.-S.-K., tilskudd (JP16km0210073, JP17km0210147, JP18km0210145) fra AMED til SK, et tilskudd (JP20km0210172) fra AMED til T.T.-S.-K. og S.K., et stipend for vitenskapelig forskning (C) (JP19K06780) fra Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) til T.T.-S.-K., og et stipend til vitenskapelig forskning på innovative områder (JP18H05552) fra JSPS til S.K.
Materials
| Acetic acid | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 017-00256 | For embryo collection |
| Agar powder | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 010-08725 | For embryo collection |
| Calcium chloride | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 038-24985 | For EBR solution |
| Capillary | Sutter Instrument | B100-75-10-PT | BOROSILICATE GLASS; O.D: 1.0mm, I.D: 0.75mm , length: 10cm, 225Pcs |
| Capillary holder | Eppendorf | 5196 081.005 | Capillary holder 4; for micromanipulation |
| Chromic acid mixture | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 037-05415 | For needle washing |
| CPA solution | 1x EBR containing 20% ethylene glycol and 1M sucrose | ||
| Double-sided tape | 3M | Scotch w-12 | For glue extracting |
| Ephrussi–Beadle Ringer solution (EBR) | 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, and 10 mM Hepes at pH 6.9 | ||
| Ethanol (99.5) | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 057-00451 | For embryo collection |
| Ethylene glycol | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 054-00983 | For CPA solution |
| Falcon 50 mm x 9 mm bacteriological petri dish | Corning Inc. | 351006 | For embryo collection |
| Forceps | Vigor | Type5 Titan | For embryo handling |
| Grape juice | Asahi Soft Drinks Co., LTD. | Welch's Grape 100 | For embryo collection |
| Grape juice agar plate | 50% grape juice, 2% agar, 1% ethanol, 1% acetic acid | ||
| Heptane | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 084-08105 | For glue extracting |
| Humidifier | APIX INTERNATIONAL CO., LTD. | FSWD2201-WH | For embryo preparation |
| Inverted microscope | Leica Microsystems GmbH | Leica DM IL LED | For micromanipulation |
| Luer-lock glass syringe | Tokyo Garasu Kikai Co., Ltd. | 0550 14 71 08 | Coat a plunger with silicon oil (FL-100-450CS);for micromanipulation |
| Mechanical micromanipulator | Leica Microsystems GmbH | For micromanipulation | |
| Micro slide glass | Matsunami Glass Ind., Ltd. | S-2441 | For embryo aligning |
| Microgrinder | NARISHIGE Group | Custom order | EG-401-S combined EG-401 and MF2 (with ocular lens MF2-LE15 ); for needle preparation |
| Microscope camera | Leica Microsystems GmbH | Leica MC170 HD | For micromanipulation |
| Needle holder | Merck KGaA | Eppendorf TransferTip (ES) | For cryopreservation |
| Potassium chloride | Nacalai Tesque, Inc. | 28514-75 | For EBR solution |
| Puller | NARISHIGE Group | PN-31 | For needle preparation; the heater level is set to 85.0-98.4, the magnet main level to 57.8, and the magnet sub level to 45.0. |
| PVC adhesive tape for electric insulation | Nitto Denko Corporation | J2515 | For embryo-pool frame |
| Silicon oil | Shin-Etsu Chemical, Co, Ltd. | FL-100-450CS | For embryo handling |
| Sodium chloride | Nacalai Tesque, Inc. | 31320-05 | For EBR solution |
| Sodium hypochlorite solution | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 197-02206 | Undiluted and freshly prepared; for embryo breaching |
| Sucrose | Nacalai Tesque, Inc. | 30404-45 | For CPA solution |
Referências
- Brüschweiler, W., Gehring, W. A method for freezing living ovaries of Drosophila melanogaster larvae and its application to the storage of mutant stocks. Experientia. 29, 134-135 (1973).
- Steponkus, P. L., et al. Cryopreservation of Drosophila melanogaster embryos. Nature. 345, 170-172 (1990).
- Mazur, P., Cole, K. W., Hall, J. W., Schreuders, P. D., Mahowald, A. P. Cryobiological preservation of Drosophila embryos. Science. 258 (5090), 1932-1935 (1992).
- Zhan, L., Li, M. G., Hays, T., Bischof, J. Cryopreservation method for Drosophila melanogaster embryos. Nat Comm. 12, 2412 (2021).
- Van Deusen, E. B. Sex determination in germ line chimeras of Drosophila melanogaster. Development. 37 (1), 173-185 (1977).
- Breen, T. R., Duncan, I. M. Maternal expression of genes that regulate the bithorax complex of Drosophila melanogaster. Dev Biol. 118, 442-456 (1986).
- Schupbach, T., Wieschaus, E. Germline autonomy of maternal-effect mutations altering the embryonic body pattern of Drosophila. Dev Biol. 113, 443-448 (1986).
- Irish, V., Lehmann, R., Akam, M. The Drosophila posterior-group gene nanos functions by repressing hunchback activity. Nature. 338, 646-648 (1989).
- Hülskamp, M., Schröder, C., Pfeifle, C., Jäckle, H., Tautz, D. Posterior segmentation of the Drosophila embryo in the absence of a maternal posterior organizer gene. Nature. 338, 629-632 (1989).
- Steinmann-Zwicky, M., Schmid, H., Nöthiger, R. Cell-autonomous and inductive signals can determine the sex of the germ line of Drosophila by regulating the gene Sxl. Cell. 57 (1), 157-166 (1989).
- Stein, D., Roth, S., Vogelsang, E., Nüsslein-Volhard, C. The polarity of the dorsoventral axis in the drosophila embryo is defined by an extracellular signal. Cell. 65 (5), 725-735 (1991).
- Kobayashi, S., Yamada, M., Asaoka, M., Kitamura, T. Essential role of the posterior morphogen nanos for germline development in Drosophila. Nature. 380, 708-711 (1996).
- Asaoka, M., et al. Offspring production from cryopreserved primordial germ cells in Drosophila. Comm Biol. 4 (1), 1159 (2021).
- Blitz, I. L., Fish, M. B., Cho, K. W. Y. Leapfrogging: primordial germ cell transplantation permits recovery of CRISPR/Cas9-induced mutations in essential genes. Development. 143 (15), 2868-2875 (2016).
- Koslová, A., et al. Precise CRISPR/Cas9 editing of the NHE1 gene renders chickens resistant to the J subgroup of avian leukosis virus. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (4), 2108-2112 (2020).
- Zhang, F. Efficient generation of zebrafish maternal-zygotic mutants through transplantation of ectopically induced and Cas9/gRNA targeted primordial germ cells. J Genet Genom. 47 (1), 37-47 (2020).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. Stages of Drosophila Embryogenesis. The Embryonic Development of Drosophila. , (1997).
- Manning, A. A sperm factor affecting the receptivity of Drosophila melanogaster females. Nature. 194, 252-253 (1962).
- Kubli, E. Sex-peptides: seminal peptides of the Drosophila male. Cell Mol Life Sci. 60, 1689-1704 (2003).
- Lehmann, R., Nüsslein-Volhard, C. Abdominal segmentation, pole cell formation, and embryonic polarity require the localized activity of oskar, a maternal gene in drosophila. Cell. 47 (1), 141-152 (1986).
- Kiger, A. A., Gigliotti, S., Fuller, M. T. Developmental genetics of the essential Drosophila Nucleoporin nup154: allelic differences due to an outward-directed promoter in the P-element 3′ end. Genética. 153 (2), 799-812 (1999).
- Rienzi, L. F., et al. Perspectives in gamete and embryo cryopreservation. Semin Reprod Med. 36 (5), 253-264 (2018).
