Summary
تقدم هذه المقالة بروتوكولا مبسطا لإنشاء نموذج التهاب لب السن في الفئران باستخدام هفوة الفم المبتكرة ، يليها التحليل النسيجي اللاحق.
Abstract
التهاب لب السن ، وهو سبب شائع لفقدان الأسنان الطبيعي ، يؤدي إلى نخر وفقدان النشاط الحيوي في لب الأسنان الملتهب. يعد الكشف عن الآليات الكامنة وراء التهاب لب السن وعلاجه الفعال محورا مستمرا لأبحاث اللبية. لذلك ، فإن فهم العملية الالتهابية داخل لب الأسنان أمر حيوي لتحسين الحفاظ على اللب. بالمقارنة مع التجارب الأخرى في المختبر ، يقدم نموذج التهاب لب الفئران سياقا أكثر أصالة وتنوعا وراثيا لمراقبة التطور المرضي لالتهاب لب السن. ومع ذلك ، فإن استخدام الفئران ، على الرغم من فعاليتها من حيث التكلفة وإمكانية الوصول إليها ، يشكل صعوبات بسبب صغر حجمها وضعف التنسيق وانخفاض تحملها ، مما يعقد الإجراءات داخل الفم والأسنان. يقدم هذا البروتوكول تصميما جديدا وتطبيقا لكمامة الفم لكشف لب الفأر ، مما يسهل إجراءات أكثر كفاءة داخل الفم. هفوة الفم ، التي تتكون من قوس أسنان متاح بسهولة لمعظم أطباء الأسنان ويمكن أن تسرع بشكل كبير من التحضير الجراحي ، حتى بالنسبة للإجراءات لأول مرة. تم استخدام التصوير المقطعي المحوسب الدقيق ، وتلطيخ الهيماتوكسيلين يوزين (HE) ، وتلطيخ التألق المناعي لتحديد التغيرات في التشكل والتعبير الخلوي. الهدف من هذه المقالة هو مساعدة الباحثين على إنشاء إجراء أكثر قابلية للتكرار وأقل تطلبا لإنشاء نموذج التهاب اللب باستخدام هفوة الفم الجديدة هذه.
Introduction
لب الأسنان ، وهو جزء لا يتجزأ من السن ، مسؤول عن وظائف أساسية متعددة مثل إمدادات المغذيات ، وتشكيل العاج ، والوظيفة الحسية ، وردود الفعل الدفاعية1. ومع ذلك ، فإن لب الأسنان ، المحاط بالأنسجة الصلبة ، عرضة للإصابات والأضرار الناجمة عن التسوس العميق أو التهاب لب السن أو الصدمات أو العلاجات اللاحقة 2,3. عدم وجود لب الأسنان الوظيفي يزيد من خطر هشاشة الأسنان4. علاوة على ذلك ، فإن فقدان حيوية اللب في الأسنان الدائمة الشابة يمكن أن يؤثر سلبا على نضوج الأسنان ، وتفشل تقنيات أطقم الأسنان الحالية في استعادة ردود الفعل العصبية التي يوفرها اللبالصحي 4. وقد دفع هذا الوضع الباحثين إلى استكشاف حلول بديلة لإدارة اللب الملتهب بما يتجاوز مجرد الإزالة.
في عام 2007 ، بدأ موراي وآخرون تطبيق هندسة الأنسجة في علاج جذور الأسنان التجديدي ، مما أثار اهتماما متزايدا بالحفاظ على اللب وتجديده5. ومع ذلك ، تشكل أنسجة اللب الملتهبة تحديا حيث تطلق الخلايا عوامل التهابية مثل IL-6 ، والتي تجند الخلايا الالتهابية وتؤدي إلى نخر الخلايا وفقدان حيوية اللب ومضاعفات في الانتعاش الوظيفي 6,7. لذلك ، فإن فهم الالتهاب وموت الخلايا المرتبط به أمر بالغ الأهمية للتقدم في الحفاظ على اللب الحيوي. هناك عدد من التجارب التي أجريت لاستكشاف البيولوجيا الجزيئية لللب الملتهب في الجسم الحي أو في المختبر 8,9. على الرغم من أن التجارب في المختبر مثل مزارع الخلايا 2D أو 3D قد تم تطويرها لسنوات وأصبحت ناضجة وتستخدم على نطاق واسع لاختبار تفاعلات خلايا اللب مع العوامل الالتهابية ، إلا أن هذه التجارب لا يمكن أن تعكس التفاعل بين أنسجة اللب والجهاز المناعي الجهازي10. إذا كانت الظاهرة قيد الدراسة مشتقة من خلايا من أصل نسيجي آخر مثل الجهاز المناعي والأوعية الدموية والجهاز العصبي ، فإن زراعة خلايا اللب النقية ستؤدي إلى طريق مسدود. لذلك ، في التجارب في الجسم الحي ضرورية للغاية ومرجعية.
أصبحت الفئران بشكل متزايد خيارا شائعا في أبحاث الالتهابات في الجسم الحي بسبب فعاليتها من حيث التكلفة وخصوبتها العالية وحيويتها. ومع ذلك ، لا يوجد حاليا بروتوكول شامل لنموذج التهاب لب الفئران ، والذي يمكن أن يكون بمثابة مرجع. يشكل صغر حجم الفئران وحساسيتها للتحفيز تحديات كبيرة أثناء الإجراءات التجريبية. غالبا ما تتطلب مراقبة الأسنان الصغيرة المخبأة في عمق فم الفأر استخدام مجهر ناتئ ، على الرغم من الوجود الأكثر شيوعا للمجاهر المكتبية في المختبرات. يتطلب عدم وجود فتاحة الفم مساعدة من الآخرين. لمعالجة هذا الأمر ، ابتكرت المجموعة هفوة الفم باستخدام المواد المتاحة بسهولة والتي تهدف إلى توفير بروتوكول موحد وقابل للتكرار لبناء نموذج التهاب لب الفئران. توضح هذه المقالة تفاصيل الإجراء ، الذي يغطي التحضير قبل الجراحة ، والشلل ، وجراحة التعرض لللب ، وجمع العينات على الفئران C57. يوصي هذا البروتوكول باستخدام كمامة الفم ، وتوفير معلومات عن هيكلها وإنتاجها وتطبيقها لتسهيل الباحثين الآخرين في تكرار الإجراء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على الإجراءات التجريبية في هذه الدراسة من قبل اللجنة الأخلاقية لمدرسة غرب الصين لطب الأسنان ، جامعة سيتشوان (WCHSIRB-D-2021-125). تم الحصول على الفئران البالغة C57BL / 6 من شركة Gempharmatech Experimental Animals Company ، تشنغدو ، الصين. يندلع التاج الكامل للضرس الأول الفكي العلوي بعد 21 يوما من الولادة. يجب أن تكون الفئران للجراحة أكبر من 21 يوما مع حيوية طبيعية11. هنا ، تم استخدام الفئران البالغة من العمر 6 إلى 8 أسابيع للنمذجة. الشكل 1 هو مخطط تدفق يوضح البروتوكول المستخدم.
1. التحضير قبل الجراحة (الشكل 2)
- احصل على الأدوات التالية: مجهر مجسم ، لوحة تثبيت ، شريط طبي ، هفوة الفم ، لدغ أسنان طفيف التوغل بقطر 0.6 مم ، قبضة أسنان عالية السرعة للأسنان ، ملف 8 # C + ، وسادة تسخين ، حقنة 1 مل ، كرة قطنية معقمة ، ملقط العين.
- الحصول على الأدوية التالية: مزيج التخدير ، مرهم بيطري.
2. إعداد هفوة الفم
- وزن وتخدير الفأر عن طريق الحقن داخل الصفاق لمحلول مزيج التخدير (10٪ كيتامين هيدروكلوريد + 5٪ زيلازين + 85٪ محلول ملحي متساوي التوتر معقم) عند 0.007 مل / جم من وزن الجسم وتأكيد التخدير المناسب من خلال طريقة قرصة إصبع القدم. ضع مرهم تشحيم العيون على العينين لمنع إصابة العينين بسبب الجفاف أثناء العملية.
ملاحظة: القبعات الطبية والأقنعة والقفازات وزرة وغيرها من الحماية الأساسية ضرورية. تأكد من أن كل من بيئة الجراحة وغرفة الماوس نظيفة وآمنة. من الضروري وجود وسادة حرارية للدعم الحراري طوال الإجراء. - تحضير هفوة الفم كما هو موضح أدناه (الشكل 3).
- احصل على المواد التالية: سلك قوس تقويم الأسنان بقطر 8 ميكرومتر ، ذو طيات ثني حلقة صغيرة ، قاطع سلك ثقيل ، قلم تحديد ، غطاء مطاطي بطول 3 مم وقطر مقطع عرضي 1 مم.
- أولا ، قم بتصويب السلك المقوس باليد اليسرى للتثبيت والإبهام ، ثني إصبع السبابة لليد اليمنى قليلا ضد قوس السلك. كرر هذا الإجراء عدة مرات ، وسوف يسهل الانحناء إلى الزاوية ثلاثية الأبعاد الصحيحة.
- استخدم ذو طيات ثني حلقة يونغ لثني الحافة العلوية (الشكل 3G ، a-i) لشبه المنحرف (الشكل 3C ، a-l-k-b) بطول حوالي 8 مم عند نقطة منتصف سلك القوس. تأكد من أن النقطة a (الشكل 3) على حافة منقار الكماة.
- امسك الزردية باليد اليسرى ، وقم بتثبيت الطرف الحر لسلك القوس بالإبهام الأيمن والسبابة ، وثني سلك القوس من النقطة أ لعمل زاوية حوالي 120 درجة. كرر الإجراء السابق عند النقطة i (الشكل 3G). تحقق مما إذا كان سلك القوس على مستوى واحد عن طريق وضعه على طاولة أفقية دون التحديق.
- اترك حوالي 9 مم من الطول على كل جانب (الشكل 3D ، a-b ، l-k) وثني الطرف الحر بزاوية 75 درجة باستخدام نفس مهارة الخطوة 2.2.4 ، مع التأكد من أن كل حافة على مستوى واحد. ثني هذه الزاوية الحادة مع طرف منقار ذو طيات.
- أوجد النقطة c حوالي 5 مم من النقطة b. اتبع نفس المهارة لثني زاوية 105 درجة على النقطة ج. ثني زاوية أخرى 105 درجة عند النقطة d 5 مم من النقطة c. اترك حوالي 4.5 مم من النقطة d وابحث عن النقطة e. ثني الطرف الحر عند النقطة e لتشكيل زاوية حوالي 100 -105 درجة (الشكل 3E).
ملاحظة: كانت الفئران C57 البالغة من العمر 6-8 أسابيع التي استخدمناها حوالي 20 جم. لا يمكن أن يؤدي تباعد 5 مم إلى تشويش الفكين العلوي والسفلي للفئران دون تحريك ، ولكن أيضا لن يضغط على جلد الفئران ويسبب عدم الراحة. إذا تم استخدام أنواع أو أعمار أخرى من الفئران ، يرجى ضبط طول أجزاء c-d و i-h وفقا للوضع الفعلي (الشكل 3E ، G). - ثني خافض اللسان الإضافي لجزء الفك السفلي (الشكل 3G ، j-i-h-g).
- تكرار خطوات الانحناء للجزء a-b-c على الجزء l-k-j. قم بتثبيت أجزاء i-k و k-j في نفس الوقت وثني الطرف الحر عند النقطة j لجعله عموديا على مستوى i-k-j. نقطة المشبك i التي تبعد 5 مم عن النقطة j ، ثني الطرف الحر لجعله موازيا لكل من مستوى i-k-j وجزء c-d (الشكل 3H).
- اترك طول 5 مم من النقطة i ، عند النقطة h ، ثني القوس الرأسي إلى جزء i-h ومواز لمستوى j-i-h. ابحث عن النقطة g عند 5 مم من النقطة h. المشبك j-i-h-g الطائرة وثني نهاية حرة متناظرة لجزء k-j. ثم يجب أن تكون النهاية الحرة بعد النقطة f متناظرة مع النهاية الخالية من النقاط الإلكترونية (الشكل 3H).
- ضع أغطية مطاطية على الطرف الحر (الشكل 3F).
3. الشلل
- إصلاح الماوس ضعيف على لوحة التثبيت مع الأطراف المؤمنة بشريط الجلد. ضغط الأطراف الحرة من هفوة الفم مع الإبهام والسبابة.
- إصلاح القواطع الأمامية الماوس في الأخدود شبه منحرف من ذراعين. تأكد من أن الذراع مع خافض اللسان هو للفك السفلي. اضبط كمامة الفم للتأكد من تثبيت لسان الفأر ولكن ليس نقص تروية.
4. تقييم الأسنان
- تأكد من أن الضرس الأول الفكي العلوي للجراحة يجب أن يكون خاليا من تسوس الأسنان والصدمات وتكون الأسنان. تأكد من عدم وجود احمرار أو تورم أو ناسور على اللثة المحيطة. تأكد من أن الأسنان المقابلة صحية ومتاحة للعمل كمجموعة تحكم صحية.
5. التعرض اللب
- استخدم نتوءات الأسنان للحفر في الجانب الإطباقي من الضرس الأول الفكي العلوي بسرعة 20000 دورة في الدقيقة. تأكد من إزالة المينا. حافظ على العملية باستخدام قبضة الأسنان فقط في طبقة ضحلة من العاج لمنع التحفيز الحراري المفرط على أنسجة لب الأسنان12.
- في الوقت نفسه ، منع ارتفاع درجة الحرارة باستخدام حقنة لإسقاط محلول ملحي طبيعي على السن كل 3 دقائق أثناء العملية.
- ضع ملف 8 # أو 10 # C + على أدنى موضع للحفرة المحفورة واخترق العاج الأخير لفضح حجرة اللب. سيكون شعورا واضحا بالسقوط عند إزالة العاج المحلي تماما. لا تسبر عميقا جدا ، وإلا فقد يتم إخراج أنسجة لب الأسنان من حجرة اللب.
- تنظيف الشظايا حول السن. خلع هفوة الفم. انتهت الجراحة. استخدم الضرس الأول الفكي المعاكس كعنصر تحكم بدون تشغيل.
6. رعاية ما بعد الجراحة
- بعد الجراحة، يتم تطبيق كاربروفين (5 ملغ/كغ) تحت الجلد ويوضع الفأر على وسادة التسخين الحرارية الكيميائية في وضعية الانبطاح حتى الشفاء من التخدير. إطعام الفئران وتوفير مياه الشرب. يجب الإشراف على عملية الاسترداد. يجب ألا تكون أي أخرى في نفس الغرفة حتى يتم استرداد الماوس بالكامل.
7. جمع العينات وتخزينها
- القتل الرحيم للفأر مع خلع عنق الرحم تحت حالة مخدر عميق بعد 24 ساعة من العملية أو أي نقطة زمنية أخرى حسب التجربة9. قطع عضلات الهيكل العظمي المرتبطة بالفك العلوي والزيجوما بمقص العيون. إزالة الهيكل العظمي والعظام الأمامية والأنسجة الرخوة واخراج الصفيحة gnathostegite مع الأضراس الفكية.
ملاحظة: وفقا ل He et al. ، تمت الإشادة بأنه يجب جمع عينة التهاب لب السن بعد أقل من 72 ساعة بعد الجراحة لتجنب النخر الواسع في أنسجة لب الأسنان13. - قسم الغناتوستيغيت سهميا إلى نصفين وقم بتخزين الأنسجة في 4٪ بارافورمالدهيد في PBS ، درجة الحموضة 7.4 ، عند 4 درجات مئوية لتثبيت 24 ساعة.
8. التحليل النسيجي
- اغسل الأنسجة بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) وقم بإزالة الكلس منها في محلول إزالة الكلس المتغير يوميا بنسبة 5٪ EDTA و 4٪ سكروز في PBS ، درجة الحموضة 7.4 ، عند 4 درجات مئوية لمدة 2-4 أسابيع10.
- قم بتضمين 1/2 gnathostegite في البارافين وتأكد من أن الوجه السهمي بدون أسنان في الجزء السفلي من أشرطة الأنسجة.
- قطع كتلة البارافين إلى شرائح بسمك 5 ميكرومتر مع ميكروتوم البارافين. اضبط زاوية كتلة البارافين وفقا للعلاقة القريبة والبعيدة والعلوية والسفلية التي لوحظت تحت المجهر لضمان إمكانية قطع لب التاج الكامل وانثقاب الضرس الأول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم إجراء الإجراء الموصوف أعلاه على الضرس الأول الفكي الأيمن من الفئران C57BL / 6 البالغة من العمر 3 ، 6-8 أسابيع ، في حين تم الحفاظ على الأضراس الأولى للفك العلوي الأيسر كعنصر تحكم. تم استخدام نتائج الأنسجة والتألق المناعي من التحكم الفارغ ، وعينات التهاب لب السن لمدة 12 ساعة و 24 ساعة من التهاب لب السن للتوضيح.
بعد بروتوكول تحليل التصوير المقطعي المحوسب من Goldman et al.15 ، تم تأكيد التعرض لللب من خلال التصوير المقطعي المحوسب الدقيق ونمذجة إعادة البناء في الشكل 4 A-C. خضعت الشرائح السهمية للأضراس الأولى الفكية ، سواء من جانبي التحكم أو الجراحة ، لتلطيخ HE (الشكل 5). تم عرض نخر أنسجة اللب وتفكك مورفولوجيا الخلية عند هامش الجرح. تركز النخر بشكل أساسي في أنسجة اللب بالقرب من الثقب ، وكان شكل نسيج اللب على الجانب غير المفتوح طبيعيا. في 24 ساعة ، كانت معظم أنسجة اللب ، بما في ذلك لب الجذر ، سليمة شكليا. (الشكل 5).
كان تعبير IL-614 منخفضا في السيطرة ، ويمكن ملاحظة كمية صغيرة من IL-6 حول الجرح في 12 ساعة ، بينما زاد التعبير عن IL-6 بشكل ملحوظ في 24 ساعة. علاوة على ذلك ، تركز تعبير IL-6 بشكل أساسي في هامش الجرح وقرن اللب الأوسط (الشكل 6). في الشكل 6 D ، E ، يزداد عدد خلايا لب الأسنان IL-6 + ونسبة خلايا IL-6 + إلى إجمالي خلايا لب الأسنان بمرور الوقت في ثلاث نقاط زمنية. يمكن اعتبار أن المنطقة تتطور تدريجيا إلى التهاب وتتفاقم بعد التعرض لللب.
قمنا بدعوة 5 زملاء لم يسبق لهم إجراء عملية جراحية على أسنان الفك العلوي للفئران C57 لحساب وقتهم اللازم لشل حركة الفك العلوي والسفلي للفأر (المرحلة 1) وكشف الضرس الأول الفكي العلوي للفأر (المرحلة 2) باتباع الإجراء التقليدي مع شريطين مطاطيين يشيران إلى البروتوكول الذي نشره Goldman et al. أو بروتوكولنا مع هفوة الفم15. كما تم حساب الوقت اللازم لوضع المثقاب بشكل صحيح على الضرس الأول الفكي العلوي للفأر تحت المجهر للتحليل. أشارت النتائج في الشكل 3 J ، K إلى أن وقت تثبيت الفم والعثور على الضرس الأول للفكين العلوي مع كمامة الفم قد تم تقصيره بشكل كبير مقارنة بالطريقة التقليدية (P<0.05). يمكن أن يؤدي استخدام هفوة الفم إلى تحسين كفاءة التشغيل وتقليل صعوبة التشغيل.
الشكل 1: مخطط تدفق إجراء التعرض لللب. (أ) بعد التثبيت بكمامة الفم، يجب أن يكون الضرس الأول الفكي العلوي للفأر مكشوفا بالكامل تحت المجهر. (ب) استخدم قبضة أسنان عالية السرعة مع نتوءات أسنان طفيفة التوغل لإزالة مينا الإطباق والعاج السطحي للضرس الأول ولكن احرص على عدم اختراق العاج مباشرة لتجنب التأثير المفرط على اللب الناجم عن ارتفاع درجة الحرارة. (C) استخدم ملف 8 # C + لاختراق العاج المتبقي وكشف اللب. (د) جمعت العينات بعد 24 ساعة من الجراحة. أثبت HE وتلطيخ التألق المناعي أنه يمكن إنشاء نموذج التهاب لب السن في هذه المرحلة الزمنية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: معدات لإجراء التعرض لللب. (أ) مجهر مجسم ومحرك قبضة الأسنان عالية السرعة. (ب) ملف 8 # C + ، لدغ الأسنان طفيف التوغل ، هفوة الفم ، الملقط ، وقبضة الأسنان عالية السرعة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: جعل الفم يكمأ. (أ) ثني السلك لعمل ذراعين عاملين من كمامة الفم. (ب-ج) خطوات ثني ملعقة اللسان للفك السفلي. (د-هاء) لا ملعقة اللسان للفك العلوي. (و ، ح) هناك حاجة إلى أغطية مطاطية أو نهايات منحنية لحماية الإصابة من الوخز. (ز) ثلاثة مناظر لكمامة الفم كمرجع. (ط) الاستخدام السريري لكمامة الفم. (ي) متوسط الوقت للمبتدئين لإصلاح الفكين العلوي والسفلي (المرحلة 1) باستخدام طريقة التثبيت التقليدية وكمامة الفم ، على التوالي. (ك) متوسط الوقت للمبتدئين للعثور بوضوح على الضرس الأول الفكي العلوي (المرحلة 2) باستخدام طريقة التثبيت التقليدية وكمامة الفم ، على التوالي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تحليل التصوير المقطعي المحوسب الدقيق لضرس القبضة الذي يتم تشغيله مع ثقب مميز بخط منقط أحمر. (أ) المستوى السهمي للأسنان ، تأكد من عدم وجود ثقب على أرضية غرفة اللب. ب: الطائرة الإكليلية. المقابلة للثقب في (A) ، يمكن ملاحظة الاختراق الكامل لعاج المينا المحاط بخط أحمر منقط. (ج) المستوى الإطباقي لنموذج إعادة بناء التصوير المقطعي المحوسب. يتم تأكيد موقع الثقب المحاط بخط أحمر منقط بطريقة أكثر سهولة ويمكن ملاحظة أرضية حجرة اللب من خلال التثقيب. (د-ز) صور أثناء العملية للعلاج. (د) افحص الضرس الأول الفكي للفأر للتأكد من عدم وجود تجاويف أو تشوه. ه: استخدام نتوءات طفيفة التوغل لإزالة المينا والعاج الضحل. كما يتضح من الصورة ، يمكن ملاحظة حفرة (محاطة بدائرة بخط أبيض متقطع) على الوجه الإطباقي للسن دون ثقب. (F) باستخدام ملف 8 # C + لاختراق العاج المتبقي ، يمكن أن يعلق الملف في السن دون دعم اليد. (ز) عند إزالة الملف ، يكون للسن ثقب وردي ، مما يشير إلى تعرض اللب بنجاح. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تلطيخ الهيماتوكسيلين-يوزين. أ: نظرة شاملة للضرس الأول غير المعالج للسيطرة. (أ-1،2،3) أرقام التكبير العالية المقابلة ل 1 ، 2 ، 3 في اللوحة (A). كان شكل أنسجة لب الأسنان في 3 أوضاع سليما ، وكانت الأرومات السنية في ترتيب منظم. (ب) عرض شامل للأسنان بعد 12 ساعة من الجراحة. (ب-1،2،3) أرقام التكبير العالية المقابلة ل 1 ، 2 ، 3 في اللوحة (B). كان شكل أنسجة لب الأسنان في الموضع 1 و 2 سليما بشكل عام. يمكن ملاحظة النخر بالقرب من الانثقاب. (ج) عرض شامل للأسنان بعد 24 ساعة من الجراحة. (ج-1،2،3) أرقام التكبير العالية المقابلة ل 1 ، 2 ، 3 في اللوحة (C). يمتد النخر من قرن لب واحد إلى أنسجة اللب القريبة. لكن معظم أنسجة اللب ، بما في ذلك لب الجذر سليمة شكليا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: تلطيخ التألق المناعي. (أ) نظرة شاملة للضرس الأول غير المعالج للسيطرة. (أ-1،2،3) أرقام التكبير العالية المقابلة ل 1 ، 2 ، 3 في اللوحة (A). لا يمكن ملاحظة أي تعبير تقريبا عن IL-6. (ب) عرض شامل للأسنان بعد 12 ساعة من الجراحة. (ب-1، 2، 3) أرقام التكبير العالية المقابلة ل 1 ، 2 ، 3 في اللوحة (B). زيادة IL-6 تتركز في الأنسجة بالقرب من ثقب كما هو موضح في B-3. لم تلاحظ أي تغييرات واضحة في B-1,2. (ج) عرض شامل للأسنان بعد 24 ساعة من الجراحة. (ج-1، 2، 3) أرقام التكبير العالية المقابلة ل 1 ، 2 ، 3 في اللوحة (C). زاد التعبير عن IL-6 بشكل ملحوظ في C-2،3. (د) إجمالي كمية خلايا لب الأسنان IL-6 + في السيطرة ، والتعرض لللب لمدة 12 ساعة ، ونتائج تلطيخ اللباب المناعي للتعرض لمدة 24 ساعة. (ه) نسبة خلايا IL-6 + إلى إجمالي كمية خلايا لب الأسنان الخاضعة للتحكم ، والتعرض لللب لمدة 12 ساعة ، ونتائج تلطيخ اللباب المناعي لمدة 24 ساعة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نظرا لأن الأنسجة الرخوة الانفرادية داخل الأسنان ، يؤدي لب الأسنان دورا مهما في الحفاظ على النشاط الحيوي للأسنان ولكنه يظل شديد الحساسية. أصبح الحفاظ على هذا اللب الحيوي هو النهج الأولي المفضل في العلاجات اللبية الحديثة ، مما يستلزم فهما شاملا للآليات الالتهابية لب الأسنان16. إن التذبذب الزماني المكاني للبيئة المكروية الالتهابية والتفاعلات بين أنواع الخلايا المقيمة في التهاب لب السن يعقد تحقيقها من خلال الدراسات في المختبر 11. بدلا من ذلك ، تقدم الدراسات في الجسم الحي فوائد من خلال تكرار البيئة الفسيولوجية الموجودة في البشر. يوفر استخدام فئران التجارب ، وتحديدا تلك التي تحتوي على جينات مفرطة في التعبير أو مدمرة ، أداة فعالة للتحقق من صحة الفرضيات. ومع ذلك ، فإن الفئران C57 المستخدمة بشكل متكرر في المختبرات تشكل تحديات بسبب صغر حجمها ونقص التنسيق ، مما يجعل تطبيق المحفزات على أسنانها مشكلة17. لمعالجة هذه المشكلة ، هناك حاجة إلى شرح شامل لكمامة الفم الجديدة لمساعدة الباحثين في تنفيذ الإجراءات داخل تجاويف الفم للفئران. علاوة على ذلك ، توضح هذه المقالة بروتوكول إنشاء نموذج التهاب لب السن من خلال التعرض لللب على الضرس الأول للفئران باستخدام كمامة الفم ، وبالتالي تقديم دليل قيم للبحث اللاحق.
بعد العديد من التكرارات ، تم تصميم هفوة الفم القابلة للتطوير والتي يسهل بناؤها بنجاح. يتم توفير الأبعاد ومخطط ثلاثي العرض لكمامة الفم في الشكل 3. قام البروتوكول بتبسيط عملية ثني الأسلاك بشكل كبير من خلال اعتماد تصميم شبه منحرف بدلا من القوس. تستخدم كمامة الفم سلك قوس تقويم أسنان بقطر 0.8 مم ، والذي يوازن بين الحاجة إلى منع الانزلاق من فم الماوس وتوفير قوة فتح كافية. علاوة على ذلك ، فإن مرونة سلك قوس تقويم الأسنان تحمي المفصل الصدغي الفكي للفئران. هفوة الفم مضغوطة ومقاومة للتآكل ويمكن تخزينها في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل مع الكحول للاستخدام المتكرر. على الرغم من ضغط عض الفأر ، تظل هفوة الفم مستقرة في الفم ، مما يسمح للباحثين بالعمل دون مساعدة تحت المجهر. وتجدر الإشارة إلى أنه يمكن تعديل حجم كمامة الفم لتناسب أحجام جسم الماوس المختلفة. إذا كان الفم ممتدا إلى ما وراء حد الماوس ، فيجب إزالة هفوة الفم على الفور لتجنب إصابة المفصل الصدغي الفكي (TMD) أو عضلات الوجه والفكين.
يشير تقرير He et al. إلى أنه يمكن اكتشاف النخر بعد 24 ساعة من التعرض لللب ، حيث تصبح غالبية أنسجة اللب نخرية بعد 72 ساعة18. وبالتالي ، من الضروري جمع أنسجة اللب داخل نافذة 72 ساعة هذه لتجنب الاستنتاجات التجريبية غير الصالحة بسبب الخلايا الميتة المفرطة. عند إدخال ملف C + في حجرة اللب ، يجب تجنب الدوران المتكرر والدفع العميق لمنع التلف المفرط لأنسجة اللب. في حالة حدوث نزيف حاد أثناء العملية ، يوصى بإزالة الدم بلطف باستخدام كرة قطنية صغيرة لمنع السعال. يجب إجراء العملية على جانب واحد فقط من الفك العلوي للفأر بسبب التأثير السلبي المحتمل على دقة النموذج من النمذجة المتزامنة على كلا الجانبين ، مما قد يتسبب في مضاعفات المدخول الغذائي. بعد الجراحة ، ينصح بعدم إعطاء الأدوية المضادة للالتهابات أو المضادات الحيوية للفئران.
على الرغم من أن هفوة الفم فعالة في الحفاظ على فم الفأر مفتوحا ، إلا أن لها قيودا تتعلق بموقع الجراحة. غالبا ما تكون أسنان الفك السفلي الخلفية ، المحمية باللسان المضغوط بخافض اللسان ، غير مرئية بوضوح. لذلك ، فإن الإجراء مناسب فقط للعمليات على أسنان الفك العلوي أو أسنان الفك السفلي الأمامية. إذا تجاوزت الجراحة 20 دقيقة ، فمن المستحسن إعطاء الفأر استراحة كل 10 دقائق لأن استقرار الفم يعتمد على استعداء قوة انسداد الفئران. الفئران C57 ، التي تم اختيارها لتكاثرها السريع وتوافرها ، حساسة لمختلف المحفزات. وبالتالي ، يمكن أن تكون جرعة زائدة طفيفة من الأدوية أو المنبهات قاتلة. علاوة على ذلك ، يتطلب صغر حجم أسنانهم مستوى مهارة أعلى لتقطيع الأنسجة.
في الختام ، يمثل التهاب اللب والنخر تحديات ملحة في تجديد اللب. تقدم هذه الدراسة عرضا شاملا لإنشاء نموذج التهاب لب السن في الفئران ، مع نتائج التألق المناعي للتحقق من العوامل الالتهابية. تقترح هذه المقالة تصميما جديدا ومريحا لكمامة الفم ، والذي يوفر للمشغل رؤية دون عائق عن طريق إبقاء فم الماوس مفتوحا دون تدخل اللسان. ومع ذلك ، لا تزال العمليات على الأسنان الخلفية للفك السفلي تمثل تحديا. بالنظر إلى مزايا استخدام فئران التجارب ، فإن النمذجة اللبية في الفئران تحمل وعدا كبيرا ، ومن المخطط توقع المزيد من التخفيضات في العتبة التقنية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تم تمويل هذه الدراسة من خلال منح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين U21A20368 (L. Y.) ، 82101000 (HW) ، و 82100982 (FL) ، وبرنامج سيتشوان للعلوم والتكنولوجيا 2023NSFSC1499 (H. W.). يتم تضمين جميع البيانات والصور الأصلية في هذه الورقة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal | |||
| C57/B6J mice | Gempharmatech Experimental Animals Company | C57/B6J | For the establishment of pulp exposure |
| Equipment | |||
| 1 mL syringe | Chengdu Xinjin Shifeng Medical Apparatus & Instruments Co. LTD. | SB1-074(IV) | Apply in drug injection. |
| 8# C+ file | Readysteel | 0010047 | Apply in exposing the roof of pulp chamber. |
| Anesthesia Mix solution | 10% ketamine hydrochloride+ 5% xylazine + 85% sterile isotonic saline. | ||
| DAPI Staining Solution | Beyotime | C1005 | Apply in immunofluorescence staining for counter-staining of nucleus. |
| Dental high-speed dental handpiece | Jing yuan electronic commerce technology | WJ-422 | Apply in pulp exposure. |
| Heavy wire cutter | Jirui Medical Instrument Co., Ltd. | none | Apply inarc cutting. |
| Hematoxylin and Eosin Stain kit | Biosharp | BL700B | For the histological analysis of the slides. |
| IL-6 antibody | Novus | NBP2-89149 | Apply in immunofluorescence staining to detect the inflammation of the dental pulp. |
| Ketamine(Ketamine hydrochloride) | Vet One, Boise, Idaho, USA | C3N VT1 | 100mg/kg, IP. Apply in nesthetization. |
| Medical tap | 3M | 1530 | Apply in mice immobilization. |
| Orthodontic arch wire | Shanghai Wei Rong Medical Apparatus Co. LTD. | K417 | Diameter of 8µm |
| Round dental burr (0.6 mm) | Shofu global | 072208 | Apply in removing enamel and shallow layer of dentin. |
| Young loop bending plier | Jirui Medical Instrument Co., Ltd. | none | Apply in arc bending. |
References
- Kleinert, A., Kleinert, L., Ozimirska, M., Chałas, R. Endodontium - together or separately. Folia Morphol. 77 (3), 409-415 (2018).
- Dhillon, H., Kaushik, M., Sharma, R.
- Prati, C., Pirani, C., Zamparini, F., Gatto, M. R., Gandolfi, M. G. A 20-year historical prospective cohort study of root canal treatments. A Multilevel analysis. Int Endod J. 51 (9), 955-968 (2018).
- Su, Y., Wang, C., Ye, L. Healing rate and post-obturation pain of single- versus multiple-visit endodontic treatment for infected root canals: a systematic review. J Endod. 37 (2), 125-132 (2011).
- Murray, P. E., Garcia-Godoy, F., Hargreaves, K. M. Regenerative endodontics: a review of current status and a call for action. J Endod. 33 (4), 377-390 (2007).
- Arora, S., et al. Potential application of immunotherapy for modulation of pulp inflammation: opportunities for vital pulp treatment. Int Endod J. 54 (8), 1263-1274 (2021).
- Eramo, S., Natali, A., Pinna, R., Milia, E. Dental pulp regeneration via cell homing. Int Endod J. 51 (4), 405-419 (2018).
- Hasan, A., et al. Expression of Toll-like receptor 2, Dectin-1, and Osteopontin in murine model of pulpitis. Clin Oral Investig. 27 (3), 1177-1192 (2023).
- Wang, Y., et al. DDIT3 aggravates pulpitis by modulating M1 polarization through EGR1 in macrophages. Int Immunopharmacol. 120, 110328 (2023).
- Richert, R., et al. A critical analysis of research methods and experimental models to study pulpitis. Int Endod J. 55 (Suppl 1), 14-36 (2022).
- Huang, X. F., Zhao, Y. B., Zhang, F. M., Han, P. Y. Comparative study of gene expression during tooth eruption and orthodontic tooth movement in mice. Oral Dis. 15 (8), 573-579 (2009).
- Kwon, S. J., et al. Thermal irritation of teeth during dental treatment procedures. Restor Dent Endod. 38 (3), 105-112 (2013).
- He, Y., et al. Pulpal tissue inflammatory reactions after experimental pulpal exposure in mice. J Endod. 43 (1), 90-95 (2017).
- Karrar, R. N., et al. Molecular biomarkers for objective assessment of symptomatic pulpitis: A systematic review and meta-analysis. Int Endod J. 56 (10), 1160-1177 (2023).
- Goldman, E., Reich, E., Abramovitz, I., Klutstein, M.
- Duncan, H. F. Present status and future directions-Vital pulp treatment and pulp preservation strategies. Int Endod J. 55 (Suppl 3), 497-511 (2022).
- Shi, X., Li, Z., He, Y., Jiang, Q., Yang, X. Effect of different dental burs for experimental induction of pulpitis in mice. Arch Oral Biol. 83, 252-257 (2017).
- Du, W., et al. Indigenous microbiota protects development of medication-related osteonecrosis induced by periapical disease in mice. Int J Oral Sci. 14 (1), 16 (2022).
