שימוש בהדמיה חיה של Ex Vivo כדי לחקור חלוקות תאים ותנועות במהלך חידוש שיניים של עכבר
Summary
הדמיה חיה Ex vivo היא טכניקה רבת עוצמה לחקר התהליכים הדינמיים של תנועות תאים ואינטראקציות ברקמות חיות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול המיישם מיקרוסקופ של שני פוטונים למעקב חי אחר תאי אפיתל דנטליים בחותכות עכבר בוגרות שלמות בתרבית.
Abstract
החותכת לעכבר הגדלה ללא הרף מתגלה כמערכת מודל בעלת יכולת טיפול גבוהה כדי לחקור את הרגולציה של תאי גזע אפיתל ומזנכימליים בוגרים והתחדשות שיניים. אוכלוסיות אבות אלה מחולקות, נעות ומתמיינות באופן פעיל כדי לשמור על הומאוסטזיס רקמות ולחדש תאים אבודים באופן מגיב. עם זאת, ניתוחים מסורתיים באמצעות קטעי רקמות קבועים לא יכלו ללכוד את התהליכים הדינמיים של תנועות תאים ואינטראקציות, מה שהגביל את יכולתנו לחקור את התקנות שלהם. מאמר זה מתאר פרוטוקול לשמירה על חותכות עכבר שלמות במערכת תרבית אקספלנט ותאי אפיתל דנטליים במסלול חי באמצעות מיקרוסקופ קיטוע זמן מולטיפוטון. טכניקה זו מוסיפה לארגז הכלים הקיים שלנו למחקר דנטלי ומאפשרת לחוקרים לרכוש מידע מרחבי-זמני על התנהגויות תאים וארגונים ברקמה חיה. אנו צופים כי מתודולוגיה זו תסייע לחוקרים להמשיך ולחקור מנגנונים השולטים בתהליכים התאיים הדינמיים המתרחשים הן במהלך חידוש השיניים והן במהלך התחדשותן.
Introduction
במהלך שני העשורים האחרונים, החותכת לעכבר התפתחה כפלטפורמה רבת ערך לחקר עקרונות ויסות תאי גזע בוגרים והתחדשות שיניים 1,2. החותכת לעכבר גדלה ברציפות ומתחדשת לאורך כל חיי החיה. הוא עושה זאת על ידי שמירה על תאי גזע אפיתל ומזנכימליים, אשר יכולים לחדש את עצמם ולהתמיין לסוגי תאים שונים של השן 1,2. בעוד שתאי גזע אפיתליאליים דנטליים מולידים אמלובלסטים, המפרישים את מטריצת האמייל, תאי גזע מזנכימליים דנטליים מולידים אודונטובלסטים, צמנטובלסטים ופיברובלסטים, היוצרים דנטין, צמנטום ורצועה חניכית, בהתאמה 3,4,5,6. אספקה קבועה זו של תאים חדשים שומרת על הומאוסטזיס רקמות ומאפשרת החלפה של תאים ישנים שאבדו עקב שחיקה או פציעות 7,8. הבהרת המנגנונים התאיים והמולקולריים המווסתים את התחזוקה וההתמיינות של תאי גזע דנטליים היא אפוא מרכזית להבנת התחדשות השיניים, תחום בעל עניין הולך וגובר.
מבחינה אנטומית, חלק גדול מהחותכת של העכבר הבוגר עטוף בעצם הלסת. בזמן שהקצה החתך של השן חשוף, הקצה האפי של החותכת נכנס לתוך שקע ומחובר היטב לעצם שמסביב דרך רצועות חניכיים ורקמות חיבור (איור 1A,B). הקצה האפי של החותך הוא גם אזור הצמיחה של השן ושומר על תאי גזע ואב דנטליים הן בשכבת האפיתל והן במוך השן 9,10,11,12,13. באופן ספציפי, תאי גזע אפיתליאליים דנטליים נשמרים בקצה הבולבוסי של האפיתל, הידוע בשם ניצן אפיקלי, המכונה גם לולאה צווארית שפתיים (איור 1C). בדומה לאפיתל המעי ולאפידרמיס, חידוש האפיתל בחותכת נתמך בעיקר על ידי מחזור פעיל של תאי גזע וצאצאיהם המתווכים המתרבים מאוד, הנקראים תאים מגבירי מעבר 14,15,16,17, שניהם שוכנים בחלק הפנימי של לולאת צוואר הרחם. עם זאת, עדיין לא ברור אם אפיתל החותך מכיל ומשתמש בתאי גזע שקטים במהלך ההתחדשות. לעומת זאת, במוך השן זוהו תאי גזע מזנכימליים דנטליים פעילים ושקטים כאחד, ותאי הגזע השקטים מתפקדים כאוכלוסיית מילואים המופעלת במהלך תיקון פציעה13,18.
רבות מהתגליות על הביולוגיה של ההתחדשות וההתחדשות של החותכות בעכבר נבעו מחקירות היסטולוגיות, שבהן הדגימות מתקבלות בצמתים זמניים נפרדים, מקובעות, מעובדות ואז נחתכות לפרוסות דקות מיקרון לאורך מישור מסוים. באמצעות ניתוח מפורט של קטעים היסטולוגיים ממודלים שונים של עכברים המאפשרים מעקב אחר שושלות או הפרעות גנטיות, מדענים זיהו את שושלות התאים של אוכלוסיות אבות שונות, כמו גם את המסלולים הגנטיים והאיתות השולטים בהומאוסטזיס חותך ותיקון פציעות 19,20,21. עם זאת, התמונות הדו-ממדיות (דו-ממדיות) הסטטיות של תאים לא חיוניים במקטעים אינן יכולות ללכוד את הספקטרום המלא של התנהגויות תאיות וארגונים מרחביים ברקמה חיה, כגון שינויים בצורת התא, תנועות וקינטיקה תאית. זיהוי ומדידה של שינויים תאיים מהירים אלה, המתרחשים בקנה מידה של ציר זמן שאינו ניתן לפתרון באמצעות חתך רקמות, דורשים אסטרטגיה שונה. יתר על כן, רכישת מידע כזה היא גם קריטית להבנת האופן שבו תאים דנטליים מתקשרים זה עם זה, מגיבים לגירויי איתות שונים ומתארגנים בעצמם כדי לשמור על מבנים ותפקודים של רקמות.
הופעתו של דימות רקמות עמוק ארבע-ממדי (4D) באמצעות מיקרוסקופ דו-פוטוני22, טכנולוגיה המשלבת שלושה ממדים מרחביים עם רזולוציה טמפורלית, מתגברת על המגבלות המובנות של ניתוח היסטולוגי בכך שהיא מאפשרת בדיקה מרחבית-זמנית של צמחי רקמה בתרבית, אורגנואידים או אפילו רקמות באתרן 23,24,25,26 . לדוגמה, הדמיה חיה 4D של אפיתל השן המתפתח חשפה את הדפוסים המרחביים-זמניים של חלוקות תאים ונדידה המתאמים צמיחת רקמות, היווצרות מרכזי איתות ומורפוגנזה אפיתל דנטלי 27,28,29,30,31,32. בחותך עכבר בוגר, הותאמה לאחרונה הדמיה 4D לחקר התנהגויות תאיות במהלך תיקון פגיעה באפיתל דנטלי. הדמיה חיה גילתה כי תאים בין-בינוניים בשכבה העל-בסיסית יכולים להיות מומרים ישירות לאמלובלסטים בשכבת הבסיס כדי לחדש את האפיתל הפגוע, מה שמאתגר את הפרדיגמה המסורתית של תיקון פגיעה אפיתל15.
כאן אנו מתארים את הדיסקציה, ההתרבות וההדמיה של חותך העכבר הבוגר, תוך התמקדות בתאי אפיתל בלולאה הצווארית העבתית (איור 1). טכניקה זו משמרת את חיוניות תאי השיניים למשך יותר מ-12 שעות ומאפשרת מעקב חי אחר תאים המסומנים באופן פלואורסצנטי ברזולוציה של תא יחיד. גישה זו מאפשרת לחקור את תנועת התא ונדידתו, כמו גם שינויים דינמיים בצורת התא ובכיוון החלוקה בתנאי תרבית רגילים, או בתגובות להפרעות גנטיות, פיזיקליות וכימיות.
Protocol
Representative Results
Discussion
הדמיית רקמות חיות היא טכניקה חשובה המאפשרת לנו לחקור את התהליכים וההתנהגויות הדינמיים של תאים כאשר הם נשמרים בסביבת הנישה שלהם41. באופן אידיאלי, הדמיה חיה מבוצעת in vivo עם רזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה. עם זאת, הדמיה in vivo עבור איברים יונקים יכול להיות מאתגר בשל חוסר נגישו…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים למעבדה המתקדמת למיקרוסקופיית אור/ספקטרוסקופיה של UCLA ולמרכז המצוינות של Leica Microsystems במכון הננו-מערכות של קליפורניה (RRID:SCR_022789) על אספקת מיקרוסקופ שני פוטונים. AS נתמך על ידי ISF 604-21 מהקרן הלאומית למדע. JH נתמך על ידי R03DE030205 R01DE030471 מה-NIH/NIDCR. AS ו-JH נתמכו גם על ידי 2021007 מענקים מהקרן הדו-לאומית למדע ארה”ב-ישראל (BSF).
Materials
| 24 well, flat bottom tissue culture plate | Olympus plastics | 25-107 | |
| 25x HC IRAPO motCORR water dipping objective | Leica | 11507704 | |
| Ascorbic acid (Vitamin C) | Acros Organics | 352685000 | |
| D-(+)-Glucose bioxtra | Sigma Aldrich | G7528 | |
| Delta T system | Bioptechs | 0420-4 | Including temperature control, culture dishes, and perfusion setup |
| Dissection microscope- LEICA S9E | Leica | LED300 SLI | |
| DMEM/F12 | Thermo Scientific | 11039047 | Basal media without phenol red |
| Feather surgical blade (#15) | Feather | 72044-15 | |
| Fine forceps | F.S.T | 11252-23 | |
| Glutamax | Thermo Scientific | 35050-061 | Glutamine substitute |
| Leica SP8-DIVE equipped with a 25X HC IRAPO motCORR water dipping objective | Leica | n/a | |
| low-melting agarose | NuSieve | 50080 | |
| non-essential amino acids (100x) | Thermo Scientific | 11140-050 | |
| penicillin–streptomycin | Thermo Scientific | 15140122 | 10,000 U/mL |
| Petri dish | Gen Clone | 32-107G | 90 mm |
| Rat serum | Valley Biomedical | AS3061SC | Processed for live imaging |
| Razor blade #9 | VWR | 55411-050 | |
| Scalpel handle | F.S.T | 10003-12 | |
| Scissors | F.S.T | 37133 | |
| serrated forceps | F.S.T | 11000-13 | |
| spring scissors | F.S.T | 91500-09 |
Referências
- Yu, T., Volponi, A. A., Babb, R., An, Z., Sharpe, P. T. Stem cells in tooth development, growth, repair, and regeneration. Current Topics in Developmental Biology. 115, 187-212 (2015).
- Jing, J., et al. Rodent incisor as a model to study mesenchymal stem cells in tissue homeostasis and repair. Frontiers in Dental Medicine. 3, 1068494 (2022).
- Harada, H., et al. Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and Fgf signaling. Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).
- Warshawsky, H., Smith, C. E. Morphological classification of rat incisor ameloblasts. The Anatomical Record. 179 (4), 423-445 (1974).
- Lekic, P., McCulloch, C. A. Periodontal ligament cell population: the central role of fibroblasts in creating a unique tissue. The Anatomical Record. 245 (2), 327-341 (1996).
- Takahashi, A., et al. Autocrine regulation of mesenchymal progenitor cell fates orchestrates tooth eruption. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (2), 575-580 (2019).
- Ness, A. R. Eruption rates of impeded and unimpeded mandibular incisors of the adult laboratory mouse. Archives of Oral Biology. 10 (3), 439-451 (1965).
- Smith, C. E., Warshawsky, H. Cellular renewal in the enamel organ and the odontoblast layer of the rat incisor as followed by radioautography using 3H-thymidine. The Anatomical Record. 183 (4), 523-561 (1975).
- Seidel, K., et al. Hedgehog signaling regulates the generation of ameloblast progenitors in the continuously growing mouse incisor. Development. 137 (22), 3753-3761 (2010).
- Juuri, E., et al. Sox2+ stem cells contribute to all epithelial lineages of the tooth via Sfrp5+ progenitors. Developmental Cell. 23 (2), 317-328 (2012).
- Biehs, B., et al. BMI1 represses Ink4a/Arf and Hox genes to regulate stem cells in the rodent incisor. Nature Cell Biology. 15, 846-852 (2013).
- Feng, J., Mantesso, A., De Bari, C., Nishiyama, A., Sharpe, P. T. Dual origin of mesenchymal stem cells contributing to organ growth and repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (16), 6503-6508 (2011).
- Zhao, H., et al. Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor. Cell Stem Cell. 14 (2), 160-173 (2014).
- Li, L., Clevers, H. Coexistence of quiescent and active adult stem cells in mammals. Science. 327 (5965), 542-545 (2010).
- Sharir, A., et al. A large pool of actively cycling progenitors orchestrates self-renewal and injury repair of an ectodermal appendage. Nature Cell Biology. 21 (9), 1102-1112 (2019).
- Hu, J. K. -. H., et al. An FAK-YAP-mTOR signaling axis regulates stem cell-based tissue renewal in mice. Cell Stem Cell. 21 (1), 91-106 (2017).
- Yu, F., Li, F., Zheng, L., Ye, L. Epigenetic controls of Sonic hedgehog guarantee fidelity of epithelial adult stem cells trajectory in regeneration. Science Advances. 8 (29), (2022).
- An, Z., et al. A quiescent cell population replenishes mesenchymal stem cells to drive accelerated growth in mouse incisors. Nature Communications. 9 (1), 378 (2018).
- Balic, A., Thesleff, I. Tissue interactions regulating tooth development and renewal. Current Topics in Developmental Biology. 115, 157-186 (2015).
- Yu, T., Klein, O. D. Molecular and cellular mechanisms of tooth development, homeostasis and repair. Development. 147 (2), (2020).
- Krivanek, J., Buchtova, M., Fried, K., Adameyko, I. Plasticity of dental cell types in development, regeneration, and evolution. Journal of Dental Research. 102 (6), 589-598 (2023).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Cetera, M., Leybova, L., Joyce, B., Devenport, D. Counter-rotational cell flows drive morphological and cell fate asymmetries in mammalian hair follicles. Nature Cell Biology. 20 (5), 541-552 (2018).
- Held, M., Santeramo, I., Wilm, B., Murray, P., Lévy, R. Ex vivo live cell tracking in kidney organoids using light sheet fluorescence microscopy. PLoS ONE. 13 (7), 0199918 (2018).
- Mesa, K. R., et al. Homeostatic epidermal stem cell self-renewal is driven by local differentiation. Cell Stem Cell. 23 (5), 677-686 (2018).
- Mogollón, I., Ahtiainen, L. Live tissue imaging sheds light on cell level events during ectodermal organ development. Frontiers in Physiology. 11, 818 (2020).
- Prochazka, J., et al. Migration of founder epithelial cells drives proper molar tooth positioning and morphogenesis. Developmental Cell. 35 (6), 713-724 (2015).
- Morita, R., et al. Coordination of cellular dynamics contributes to tooth epithelium deformations. PLOS ONE. 11 (9), 0161336 (2016).
- Ahtiainen, L., Uski, I., Thesleff, I., Mikkola, M. L. Early epithelial signaling center governs tooth budding morphogenesis. The Journal of Cell Biology. 214 (6), 753-767 (2016).
- Panousopoulou, E., Green, J. B. A. Invagination of ectodermal placodes is driven by cell intercalation-mediated contraction of the suprabasal tissue canopy. PLoS biology. 14 (3), 1002405 (2016).
- Mogollón, I., Moustakas-Verho, J. E., Niittykoski, M., Ahtiainen, L. The initiation knot is a signaling center required for molar tooth development. Development. 148 (9), (2021).
- Kim, R., et al. Early perturbation of Wnt signaling reveals patterning and invagination-evagination control points in molar tooth development. Development. 148 (14), 199685 (2021).
- Takahashi, M., Makino, S., Kikkawa, T., Osumi, N. Preparation of rat serum suitable for mammalian whole embryo culture. Journal of Visualized Experiments JoVE. (90), e51969 (2014).
- Katsuragi, Y., et al. Bcl11b transcription factor plays a role in the maintenance of the ameloblast-progenitors in mouse adult maxillary incisors. Mechanisms of Development. 130 (9-10), 482-492 (2013).
- Dassule, H. R., Lewis, P., Bei, M., Maas, R., McMahon, A. P. Sonic hedgehog regulates growth and morphogenesis of the tooth. Development. 127 (22), 4775-4785 (2000).
- Belteki, G., et al. Conditional and inducible transgene expression in mice through the combinatorial use of Cre-mediated recombination and tetracycline induction. Nucleic Acids Research. 33 (5), 51 (2005).
- Tumbar, T., et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin. Science. 303 (5656), 359-363 (2004).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Kimura, H., Cook, P. R. Kinetics of core histones in living human cells. The Journal of Cell Biology. 153 (7), 1341-1354 (2001).
- Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Current Biology: CB. 8 (7), 377-385 (1998).
- Huang, Q., et al. The frontier of live tissue imaging across space and time. Cell Stem Cell. 28 (4), 603-622 (2021).
- Skylaki, S., Hilsenbeck, O., Schroeder, T. Challenges in long-term imaging and quantification of single-cell dynamics. Nature Biotechnology. 34 (11), 1137-1144 (2016).
- Knoblich, J. A. Mechanisms of asymmetric stem cell division. Cell. 132 (4), 583-597 (2008).
- Li, S., et al. Overview of the reporter genes and reporter mouse models. Animal Models and Experimental. 1 (1), 29-35 (2018).
- Mort, R. L., et al. Fucci2a: a bicistronic cell cycle reporter that allows Cre mediated tissue specific expression in mice. Cell Cycle. 13 (17), 2681-2696 (2014).
- Krivanek, J., et al. Dental cell type atlas reveals stem and differentiated cell types in mouse and human teeth. Nature Communications. 11 (1), 4816 (2020).
- Dailey, M. E., Marrs, G. S., Kurpius, D. Maintaining live cells and tissue slices in the imaging setup. Cold Spring Harbor protocols. 2011 (4), (2011).
- Gorczyca, W., Bruno, S., Darzynkiewicz, R., Gong, J., Darzynkiewicz, Z. DNA strand breaks occurring during apoptosis – their early insitu detection by the terminal deoxynucleotidyl transferase and nick translation assays and prevention by serine protease inhibitors. International Journal of Oncology. 1 (6), 639-648 (1992).
- Aguilera-Castrejon, A., et al. Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis. Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).
- Wale, P. L., Gardner, D. K. Time-lapse analysis of mouse embryo development in oxygen gradients. Reproductive Biomedicine Online. 21 (3), 402-410 (2010).
- Tse, H. M., Gardner, G., Dominguez-Bendala, J., Fraker, C. A. The importance of proper oxygenation in 3D culture. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 634403 (2021).
- Spinelli, J. B., et al. Fumarate is a terminal electron acceptor in the mammalian electron transport chain. Science. 374 (6572), 1227-1237 (2021).
- Johnson, S., Rabinovitch, P. Ex-vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy. Current Protocols in Cytometry. , (2012).
- Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: a concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 79, 1-25 (2017).
- McCoy, R. J., O’Brien, F. J. Influence of shear stress in perfusion bioreactor cultures for the development of three-dimensional bone tissue constructs: a review. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 16 (6), 587-601 (2010).
- Chen, K. D., et al. Mechanotransduction in response to shear stress. Roles of receptor tyrosine kinases, integrins, and Shc. The Journal of Biological Chemistry. 274 (26), 18393-18400 (1999).
- Seddiqi, H., et al. Inlet flow rate of perfusion bioreactors affects fluid flow dynamics, but not oxygen concentration in 3D-printed scaffolds for bone tissue engineering: Computational analysis and experimental validation. Computers in Biology and Medicine. 124, 103826 (2020).
