Démonstration de la culture de feuilles cellulaires auto-assemblées et de la génération manuelle d’un organoïde 3D de type tendon/ligament à l’aide de fibroblastes dermiques humains

Summary

Dans cet article, nous démontrons un modèle organoïde en trois étapes (expansion bidimensionnelle [2D], stimulation 2D, maturation tridimensionnelle [3D]) offrant un outil prometteur pour la recherche fondamentale sur les tendons et une méthode potentielle sans échafaudage pour l’ingénierie tissulaire des tendons.

Abstract

Les tendons et les ligaments (T/L) sont des structures fortes et hiérarchisées qui unissent le système musculo-squelettique. Ces tissus ont une matrice extracellulaire (ECM) riche en collagène de type I strictement agencée et des cellules de la lignée T/L principalement positionnées en rangées parallèles. Après une blessure, les T/L nécessitent une longue période de rééducation avec un risque de défaillance élevé et des résultats de réparation souvent insatisfaisants. Malgré les progrès récents de la recherche en biologie T/L, l’un des défis restants est que le domaine T/L ne dispose toujours pas d’un protocole de différenciation standardisé capable de récapituler le processus de formation T/L in vitro. Par exemple, la différenciation osseuse et graisseuse des cellules précurseurs mésenchymateuses ne nécessite qu’une culture cellulaire bidimensionnelle standard (2D) et l’ajout de milieux de stimulation spécifiques. Pour la différenciation en cartilage, une culture tridimensionnelle (3D) de granulés et une supplémentation en TGFß sont nécessaires. Cependant, la différenciation cellulaire en tendon nécessite un modèle de culture 3D très ordonné, qui devrait idéalement être également soumis à une stimulation mécanique dynamique. Nous avons établi un modèle d’organoïde en 3 étapes (expansion, stimulation et maturation) pour former une structure 3D en forme de bâtonnet à partir d’une feuille cellulaire auto-assemblée, qui fournit un microenvironnement naturel avec ses propres facteurs ECM, autocrines et paracrines. Ces organoïdes en forme de bâtonnets ont une architecture cellulaire multicouche au sein d’une ECM riche et peuvent être manipulés assez facilement pour être exposés à des contraintes mécaniques statiques. Ici, nous avons démontré le protocole en 3 étapes en utilisant des fibroblastes dermiques disponibles dans le commerce. Nous avons pu montrer que ce type de cellule forme des organoïdes robustes et abondants en MEC. La procédure décrite peut être optimisée en termes de milieux de culture et optimisée pour la stimulation mécanique axiale dynamique. De la même manière, d’autres sources cellulaires peuvent être testées pour leur potentiel à former des organoïdes T/L et donc à subir une différenciation T/L. En résumé, l’approche éprouvée des organoïdes 3D T/L peut être utilisée comme modèle pour la recherche fondamentale sur les tendons et même pour l’ingénierie T/L sans échafaudage.

Introduction

Les tendons et les ligaments (T/L) sont des composants vitaux du système musculo-squelettique qui fournissent un soutien et une stabilité essentiels au corps. Malgré leur rôle critique, ces tissus conjonctifs sont sujets à la dégénérescence et aux blessures, provoquant des douleurs et des troubles de la mobilité¹. De plus, leur apport sanguin limité et leur capacité de guérison lente peuvent entraîner des blessures chroniques, tandis que des facteurs tels que le vieillissement, les mouvements répétitifs et une réadaptation inadéquate augmentent encore le risque de dégénérescence et^{de blessures}. Les traitements conventionnels, tels que le repos, la physiothérapie et les interventions chirurgicales, ne parviennent pas à restaurer complètement la structure et la fonction T/L. Au cours des dernières années, les chercheurs se sont efforcés de mieux comprendre la nature complexe de la T/L afin de trouver des traitements efficaces pour les troubles T/L ^3,4,5. Les T/L se distinguent par une structure hiérarchiquement organisée, dominée par la matrice extracellulaire (ECM), composée principalement de fibres de collagène de type I et de protéoglycanes, une caractéristique difficile à reproduire in vitro⁶. Les modèles traditionnels de culture cellulaire bidimensionnelle (2D) ne parviennent pas à capturer l’organisation tridimensionnelle (3D) caractéristique des tissus T/L, ce qui limite leur potentiel de traduction et entrave les progrès innovants dans le domaine de la régénération T/L.

Récemment, le développement de modèles organoïdes 3D a offert de nouvelles possibilités pour faire progresser la recherche fondamentale et l’ingénierie tissulaire sans échafaudage de divers types de tissus 7,8,9,10,11,12,13. Par exemple, pour étudier la jonction myotendineuse, Larkin et al. 2006 ont développé des constructions musculaires squelettiques 3D avec des segments de tendon auto-organisés dérivés du tendon¹⁰ de la queue de rat. De plus, Schiele et al. 2013, en utilisant des canaux de croissance micro-usinés recouverts de fibronectine, ont dirigé l’auto-assemblage des fibroblastes dermiques humains pour former des fibres cellulaires sans l’aide d’un échafaudage 3D, une approche qui peut capturer les traits clés du développement des tendons embryonnaires¹¹. Dans l’étude de Florida et al. 2016, les cellules stromales de la moelle osseuse ont d’abord été étendues en lignées osseuses et ligamentaires, puis utilisées pour générer des feuilles cellulaires monocouches auto-assemblées, qui ont ensuite été mises en œuvre pour créer une construction os-ligamentaire-os multiphasique imitant le ligament croisé antérieur natif, un modèle visant à améliorer la compréhension de la régénération ligamentaire12. Pour élucider les processus de mécanotransduction tendineuse, Mubyana et al. 2018 ont utilisé une méthodologie sans échafaudage par laquelle des fibres de tendon uniques ont été créées et soumises à un protocole de charge mécanique¹³. Les organoïdes sont des structures 3D auto-organisées qui imitent l’architecture native, le microenvironnement et la fonctionnalité des tissus. Les cultures d’organoïdes 3D fournissent un modèle plus pertinent sur le plan physiologique pour l’étude de la biologie des tissus et des organes ainsi que de la physiopathologie. De tels modèles peuvent également être utilisés pour induire une différenciation tissulaire spécifique de différents types de cellules souches/progénitrices^14,15. Par conséquent, la mise en œuvre de modèles organoïdes 3D dans le domaine de la biologie T/L et de l’ingénierie tissulaire devient une approche très attrayante ^9,16. D’autres sources cellulaires peuvent être mises en œuvre pour l’assemblage de l’organoïde et stimulées vers la différenciation ténogénique. Un type de cellule pertinent utilisé pour la démonstration dans cette étude est les fibroblastes dermiques ^7,17,18. Ces cellules sont facilement accessibles grâce à une procédure de biopsie cutanée, qui est moins invasive que la ponction de la moelle osseuse ou la liposuccion et peut être multipliée assez rapidement en grand nombre en raison de leur bonne capacité de prolifération. En revanche, les types de cellules plus spécialisés, tels que les fibroblastes résidents T/L, sont plus difficiles à isoler et à développer. Par conséquent, les fibroblastes dermiques ont également été utilisés comme point de départ pour les technologies de reprogrammation cellulaire vers des cellules souches embryonnaires pluripotentes induites¹⁹. Soumettre les fibroblastes dermiques à des conditions de culture 3D spécifiques et à des signaux de signalisation, tels que le facteur de croissance transformant-bêta 3 (TGFß3), qui a été signalé comme un régulateur clé de divers processus cellulaires, y compris la formation et le maintien de T/L, peut potentialiser leur différenciation ténogénique in vitro conduisant à l’expression de gènes spécifiques du tendon et au dépôt d’ECM²⁰ typique de T/L^{, 21}. Aéroport

Ici, nous décrivons et démontrons un protocole organoïde en 3 étapes précédemment établi et mis en œuvre (expansion 2D, stimulation 2D et maturation 3D) utilisant des fibroblastes dermiques humains adultes normaux (NHDF) disponibles dans le commerce comme source cellulaire, offrant un modèle précieux pour l’étude de la ténogenèse in vitro ⁷. Malgré le fait que ce modèle n’est pas équivalent au tissu T/L in vivo, il fournit tout de même un système plus pertinent sur le plan physiologique qui peut être utilisé pour étudier les mécanismes de différenciation cellulaire, imiter la physiopathologie T/L in vitro et établir des plateformes de médecine personnalisée et de dépistage de médicaments. De plus, à l’avenir, des études pourront évaluer si les organoïdes 3D sont adaptés à l’ingénierie T/L sans échafaudage en augmentant l’optimisation et utilisables pour le développement de constructions mécaniquement robustes à l’échelle qui ressemblent étroitement aux dimensions et aux propriétés structurelles et biophysiques des tissus T/L natifs.

Protocol

REMARQUE : Toutes les étapes doivent être effectuées à l’aide de techniques aseptiques. 1. Culture et pré-expansion des NHDF Décongelez rapidement le flacon cryogénique contenant des fibroblastes dermiques humains normaux (NHDF, 1 x 106 cellules) à 37 °C jusqu’à ce qu’ils soient presque en train de décongeler. Ajouter lentement 1 mL de milieu de croissance des fibroblastes 2 préchauffé (trousse prête à l’emploi comprenant …

Representative Results

Le modèle organoïde 3D T/L a été précédemment établi et démontré ici par la mise en œuvre de NHDF achetés dans le commerce (n = 3, 3 organoïdes par donneur, NHDF ont été utilisés aux passages 5 à 8). Le flux de travail du modèle est résumé dans la figure 1. La figure 2 montre des images représentatives en contraste de phase de la culture NHDF pendant la pré-expansion dans des flacons T-75 (Figure 2A) ainsi qu’…

Discussion

Les résultats démontrés dans cette étude fournissent des informations précieuses sur l’établissement et la caractérisation du modèle organoïde NHDF 3D pour l’étude des tissus T/L. Le protocole en 3 étapes a conduit à la formation d’organoïdes 3D en forme de bâtonnets qui présentent des caractéristiques typiques de la niche T/L. Ce modèle a déjà été rapporté dans Kroner-Weigl et al. 2023⁷ et démontré en détail ici.

Les images en co…

Materials

Ascorbic acid	Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany	A8960
10 cm adherent cell culture dish	Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany	CLS430167
10 cm non-adherent petri dish	Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany	CLS430591
Cryo-medium	Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands	4583
Cryomold standard	Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands	4557
D(+)-Sucrose	AppliChem Avantor VWR International GmbH, Darmstadt, Germany	A2211
DMEM high glucose medium	Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany	DMEM-HA
DMEM low glucose	Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany	DMEM-LPXA
Fetal bovine serum	Anprotec, Bruckberg, Germany	AC-SM-0027
Fibroblast growth medium 2	PromoCell, Heidelberg, Germany	C-23020
Inverted microscope with high resolution camera	Zeiss	NA	Zeiss Axio Observer with  Axiocam 506
MEM amino acids	Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany	NEAA-B
Metal pins	EntoSphinx, Pardubice, Czech Republic	04.31
Normal human dermal fibroblasts	PromoCell, Heidelberg, Germany	C-12302
Paraformaldehyde	AppliChem, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany	A3813
Penicillin/streptomycin	Gibco, Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany	15140122
Phosphate buffer saline	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany	P4417
TGFß3	R&D Systems, Wiesbaden, Germany	8420-B3
Trypsin-EDTA 0,05% DPBS	Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany	TRY-1B