CRISPR-Cas9 genomredigering av rotteembryoer ved bruk av adenoassosiert virus (AAV) og 2-celleembryoelektroporering
Summary
Denne protokollen presenterer en optimalisert tilnærming for å produsere genetisk modifiserte rottemodeller. Adenoassosiert virus (AAV) brukes til å levere en DNA-reparasjonsmal, og elektroporering brukes til å levere CRISPR-Cas9-reagenser for å fullføre genomredigeringsprosessen i 2-celleembryo.
Abstract
Genomredigeringsteknologi er mye brukt til å produsere genetisk modifiserte dyr, inkludert rotter. Cytoplasmatisk eller pronukleær injeksjon av DNA-reparasjonsmaler og CRISPR-Cas-reagenser er den vanligste leveringsmetoden i embryoer. Imidlertid krever denne typen mikromanipulasjon tilgang til spesialutstyr, er arbeidskrevende og krever et visst nivå av teknisk ferdighet. Videre resulterer mikroinjeksjonsteknikker ofte i lavere embryooverlevelse på grunn av den mekaniske belastningen på embryoet. I denne protokollen utviklet vi en optimalisert metode for å levere store DNA-reparasjonsmaler for å fungere sammen med CRISPR-Cas9-genomredigering uten behov for mikroinjeksjon. Denne protokollen kombinerer AAV-mediert DNA-levering av enkeltstrengede DNA-donormaler sammen med levering av CRISPR-Cas9 ribonukleoprotein (RNP) ved elektroporering for å modifisere 2-celleembryoer. Ved hjelp av denne nye strategien har vi vellykket produsert målrettede knock-in rottemodeller som bærer innsetting av DNA-sekvenser fra 1,2 til 3,0 kb i størrelse med effektivitet mellom 42% og 90%.
Introduction
Utviklingen av CRISPR-baserte genomredigeringsverktøy har akselerert vår evne til effektivt å generere nye og mer sofistikerte genetisk konstruerte rottemodeller. Enkeltveiledet RNA, sammen med Cas9-nuklease, kombineres for å danne ribonukleoprotein (RNP) komplekser som retter seg mot DNA-sekvenser av interesse i genomet og resulterer i dobbeltstrengede DNA-brudd. Fordi cellulære DNA-reparasjonsmekanismer er utsatt for feil, blir innsettinger og slettinger (INDELs) introdusert under reparasjonsprosessen som kan forstyrre et målgens funksjon. Når det er samlevering av en ønsket konstruert DNA-sekvens (reparasjonsmal) sammen med genomredigeringsreagenser, skjer innsetting av reparasjonsmalen i regionen som inneholder det dobbeltstrengede DNA-bruddet gjennom en prosess som kalles homologirettet reparasjon (HDR). Dette er en effektiv strategi for å generere dyremodeller med målrettede DNA-innsettinger/substitusjoner (knock-ins). En begrensning er at innslagssekvenser ofte er store i størrelse, noe som har vist seg å redusere genredigeringseffektiviteten, og dermed gjøredet vanskeligere å generere den ønskede modellen. Strategier for å øke knock-in effektivitet har inkludert linearisering av både dobbeltstrenget DNA (dsDNA) og enkeltstrenget DNA (ssDNA) reparasjonsmaler og kjemisk modifisering av DNA-reparasjonsmaler 2,3,4. I tillegg har pronukleær mikroinjeksjon sammen med HDR-stimulerende forbindelser, påføring av elektriske pulser i forbindelse med mikroinjeksjon og tidsbestemt mikroinjeksjon i 2-celleembryoer alle blitt forsøkt 5,6,7. Til tross for suksessen til noen av disse tilnærmingene, er inkorporering av DNA-sekvenser større enn 1,0 kb fortsatt teknisk utfordrende.
Elektroporering, som er en vanlig metode for å introdusere reagenser i dyrkede cellelinjer, tilbyr et alternativ til mikroinjeksjon for å levere CRISPR-Cas9-komponenter i embryoer. Embryoelektroporering, først demonstrert i rotteembryoer8, har siden blitt brukt som en leveringsmetode hos mus 9,10,11,12,13, griser 14,15 og andre dyremodellorganismer 16,17,18. Embryoer, suspendert i mediet som inneholder CRISPR-Cas9-reagenser, plasseres i en kyvette eller på et glassglass mellom to elektroder og underkastes direkte pulser av elektriske strømmer. Dette skaper forbigående åpninger i zona pellucida og embryoplasmamembranen gjennom hvilke CRISPR-Cas9-komponentene kommer inn i embryoene. Vanligvis brukes elektriske “poring” -pulser på mellomnivå for å lage de midlertidige åpningene etterfulgt av elektriske “overføringspulser” på lavere nivå som letter bevegelsen av de negativt ladede genomredigeringskomponentene. Embryoelektroporering er effektiv, har høy gjennomstrømning og er enkel å utføre. Imidlertid, mens embryoelektroporering har vist seg å være svært vellykket for innføring av små (<200 bp) ssDNA-reparasjonsmaler, er det få rapporter om vellykket elektroporering av større (>1,0 kb) reparasjonsmaler13,19. Denne størrelsesbegrensningen representerer en stor begrensning av embryoelektroporering for å generere innbankede dyremodeller som krever store innsettinger.
I sammenheng med genterapi har adenoassosierte virus (AAV) lenge vært brukt som kjøretøy for å levere genetisk materiale på grunn av deres effektive in vivo smittsomhet av både delende og ikke-delende celler, mangel på patogenisitet og sjelden genomisk integrasjon20,21. Nylig har flere studier kombinert AAV-er med CRISPR-Cas9-teknologi for å introdusere DNA-reparasjonsmaler og CRISPR-reagenser 22,23,24. Denne tilnærmingen tillater levering av større DNA-reparasjonsmaler uten behov for mikroinjeksjonsteknikker.
HDR-banen er mer aktiv i de sene S- og G2-fasene i cellesyklusen 25,26. I studier utført in vitro ble signifikante økninger i innslagseffektivitet oppnådd ved levering av CRISPR-Cas9 RNP og DNA-reparasjonsmaler i G2-synkroniserte celler eller ved begrensning av tilstedeværelsen av Cas9-protein til sene S- og G2-faser ved bruk av et Cas9-Geminin-fusjonsprotein2. Videre er det en stor zygotisk genomaktivering (ZGA) hendelse som oppstår under den utvidede G2-fasen av 2-cellestadiet embryo, og dette er forbundet med en åpen kromatintilstand. Det spekuleres i at dette gir CRISPR-Cas9 RNP-ene og reparasjonsmalene større tilgjengelighet til genomisk DNA.
Vårt mål var å bygge videre på alle disse observasjonene, ved å kombinere AAV-tilnærmingen med embryoelektroporering for å introdusere CRISPR-Cas9 RNP på 2-cellestadiet av embryoutvikling. Denne strategien utnytter den større leveringskapasiteten til DNA-reparasjonsmalen til AAV, den tekniske brukervennligheten til elektroporering og det mer optimale 2-celle tidspunktet for genomisk tilgjengelighet under embryoutvikling for å skape en effektiv metode for målrettet genmanipulering av DNA-innsettinger. Som fremhevet i denne protokollen, tillater vår optimaliserte metode produksjon av målrettede knock-in rottemodeller som bærer innsettinger av DNA-sekvenser fra 1,2 til 3,0 kb i størrelse uten behov for mikroinjeksjonsteknikker.
Protocol
Representative Results
Discussion
CRISPR-Cas-genomredigeringssystemet har revolusjonert feltet genteknologi ved å tillate effektiv produksjon av både enkle og komplekse, tilpassede genetiske modifikasjoner i en rekke dyrearter. Hyppige forbedringer og forbedringer i teknikker knyttet til genomredigering øker allsidigheten. Her har vi beskrevet en ny tilnærming ved bruk av ssAAV-mediert DNA-levering sammen med 2-celle embryoelektroporering av CRISPR-Cas9-reagenser i 2-celle gnagerembryoer. Vi har vist at dette er en effektiv måte å produsere målret…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil takke Nolan Davis for hjelp med videografi og videoredigering.
Materials
| Leads with alligator clips for electrodes | NepaGene | C117 | |
| Mineral oil | MilliporeSigma | M5310 | |
| NepaGene21 Super Electroporator | NepaGene | NEPA21 | |
| Platinum plate electrodes on slide glass | NepaGene | CUY501P1-1.5 | |
| PURedit Cas9 Protein | MilliporeSigma | PECAS9 | |
| sgRNA (chemically-modified) | Synthego | N/A | |
| ssAAV1 or ssAAV6 packaged DNA repair template | Vectorbuilder | N/A |
References
- Lau, C. H., Tin, C., Suh, Y. CRISPR-based strategies for targeted transgene knock-in and gene correction. Fac Rev. 9, 20 (2020).
- Gutschner, T., Haemmerle, M., Genovese, G., Draetta, G. F., Chin, L. Post-translational Regulation of Cas9 during G1 Enhances Homology-Directed Repair. Cell Rep. 14 (6), 1555-1566 (2016).
- Zhang, J. P., et al. Efficient precise knockin with a double cut HDR donor after CRISPR/Cas9-mediated double-stranded DNA cleavage. Genome Biol. 18 (1), 35 (2017).
- Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knockout mouse models using long ssDNA donors. Nat Protoc. 13 (1), 195-215 (2018).
- Gu, B., Posfai, E., Gertsenstein, M., Rossant, J. Efficient generation of large-fragment knock-in mouse models using 2-cell (2C)-homologous recombination (HR)-CRISPR. Curr Protoc Mouse Biol. 10 (1), e67 (2020).
- Gu, B., Posfai, E., Rossant, J. Efficient generation of targeted large insertions by microinjection into two-cell-stage mouse embryos. Nat Biotechnol. 36 (7), 632-637 (2018).
- Kurihara, T., et al. DNA repair protein RAD51 enhances the CRISPR/Cas9-mediated knock-in efficiency in brain neurons. Biochem Biophys Res Commun. 524 (3), 621-628 (2020).
- Kaneko, T., Sakuma, T., Yamamoto, T., Mashimo, T. Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos. Sci Rep. 4, 6382 (2014).
- Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y., Modzelewski, A. J., He, L. Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes. J Biol Chem. 291 (28), 14457-14467 (2016).
- Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse. Dev Biol. 418 (1), 1-9 (2016).
- Wang, W., et al. Delivery of Cas9 protein into mouse zygotes through a series of electroporation dramatically increases the efficiency of model creation. J Genet Genomics. 43 (5), 319-327 (2016).
- Troder, S. E., et al. An optimized electroporation approach for efficient CRISPR/Cas9 genome editing in murine zygotes. PLoS One. 13 (5), e0196891 (2018).
- Teixeira, M., et al. Electroporation of mice zygotes with dual guide RNA/Cas9 complexes for simple and efficient cloning-free genome editing. Sci Rep. 8 (1), 474 (2018).
- Tanihara, F., et al. Efficient generation of GGTA1-deficient pigs by electroporation of the CRISPR/Cas9 system into in vitro-fertilized zygotes. BMC Biotechnol. 20 (1), 40 (2020).
- Tanihara, F., et al. Generation of CD163-edited pig via electroporation of the CRISPR/Cas9 system into porcine in vitro-fertilized zygotes. Anim Biotechnol. 32 (2), 147-154 (2021).
- Camargo, L. S. A., Owen, J. R., Van Eenennaam, A. L., Ross, P. J. Efficient one-step knockout by electroporation of ribonucleoproteins into zona-intact bovine embryos. Front Genet. 11, 570069 (2020).
- Lin, J. C., Van Eenennaam, A. L. Electroporation-mediated genome editing of livestock zygotes. Front Genet. 12, 648482 (2021).
- Betters, E., Charney, R. M., Garcia-Castro, M. I. Electroporation and in vitro culture of early rabbit embryos. Data Brief. 21, 316-320 (2018).
- Miyasaka, Y., et al. CLICK: one-step generation of conditional knockout mice. BMC Genomics. 19 (1), 318 (2018).
- Epstein, B. E., Schaffer, D. V. Combining engineered nucleases with adeno-associated viral vectors for therapeutic gene editing. Adv Exp Med Biol. 1016, 29-42 (2017).
- Gaj, T., Epstein, B. E., Schaffer, D. V. Genome engineering using adeno-associated virus: basic and clinical research applications. Mol Ther. 24 (3), 458-464 (2016).
- Chen, S., et al. CRISPR-READI: Efficient generation of knockin mice by CRISPR RNP electroporation and AAV donor infection. Cell Rep. 27 (13), 3780-3789 (2019).
- Mizuno, N., et al. Intra-embryo gene cassette knockin by CRISPR/CAS9-mediated genome editing with adeno-associated viral vector. iScience. 9, 286-297 (2018).
- Davis, D. J., et al. Efficient DNA knock-in using AAV-mediated delivery with 2-cell embryo CRISPR-Cas9 electroporation. Front Genome Ed. 5, 1256451 (2023).
- Smirnikhina, S. A., Zaynitdinova, M. I., Sergeeva, V. A., Lavrov, A. V. Improving homology-directed repair in genome editing experiments by influencing the cell cycle. Int J Mol Sci. 23 (11), (2022).
- Takata, M., et al. Homologous recombination and non-homologous end-joining pathways of DNA double-strand break repair have overlapping roles in the maintenance of chromosomal integrity in vertebrate cells. EMBO J. 17 (18), 5497-5508 (1998).
- Men, H., Stone, B. J., Bryda, E. C. Media optimization to promote rat embryonic development to the blastocyst stage in vitro. Theriogenology. 151, 81-85 (2020).
- Men, H., Amos-Landgraf, J. M., Bryda, E. C., Franklin, C. L. KSOM-R supports both mouse and rat preimplantation embryo development in vitro. Theriogenology. 198, 69-74 (2023).
- Romeo, C., et al. AAV diffuses across zona pellucida for effortless gene delivery to fertilized eggs. Biochem Biophys Res Commun. 526 (1), 85-90 (2020).
- Fulka, J., Moor, R. M., Fulka, J. Electrofusion of mammalian oocytes and embryonic cells. Methods Mol Biol. 48, 309-316 (1995).
- Rems, L., et al. Cell electrofusion using nanosecond electric pulses. Sci Rep. 3, 3382 (2013).
