עריכת גנום CRISPR-Cas9 של עוברי חולדות באמצעות Adeno-Associated Virus (AAV) ואלקטרופורציה של עוברים דו-תאיים
Summary
פרוטוקול זה מציג גישה אופטימלית לייצור מודלים של חולדות מהונדסות-גנטית. וירוס הקשור לאדנו (AAV) משמש להעברת תבנית תיקון DNA, ואלקטרופורציה משמשת להעברת ריאגנטים CRISPR-Cas9 כדי להשלים את תהליך עריכת הגנום בעובר בן 2 תאים.
Abstract
טכנולוגיית עריכת גנום נמצאת בשימוש נרחב לייצור בעלי חיים מהונדסים גנטית, כולל חולדות. הזרקה ציטופלזמית או פרו-גרעינית של תבניות תיקון DNA וריאגנטים CRISPR-Cas היא שיטת המסירה הנפוצה ביותר לעוברים. עם זאת, סוג זה של micromanipulation מחייב גישה לציוד מיוחד, הוא מייגע, ודורש רמה מסוימת של מיומנות טכנית. יתר על כן, טכניקות מיקרו-הזרקה לעיתים קרובות גורמות להישרדות נמוכה יותר של העובר בשל הלחץ המכני על העובר. בפרוטוקול זה, פיתחנו שיטה אופטימלית לספק תבניות גדולות לתיקון DNA שיעבדו בשילוב עם עריכת גנום CRISPR-Cas9 ללא צורך במיקרו-הזרקה. פרוטוקול זה משלב מסירת DNA בתיווך AAV של תבניות תורם DNA חד-גדילי יחד עם אספקת CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein (RNP) על ידי אלקטרופורציה לשינוי עוברים דו-תאיים. באמצעות אסטרטגיה חדשנית זו, ייצרנו בהצלחה מודלים ממוקדים של חולדות נוקבות הנושאות החדרה של רצפי DNA בגודל של 1.2 עד 3.0 קילובייט עם יעילות של בין 42% ל -90%.
Introduction
הפיתוח של כלי עריכת גנום מבוססי קריספר האיץ את יכולתנו ליצור ביעילות מודלים חדשים ומתוחכמים יותר של חולדות מהונדסות-גנטית. רנ”א חד-מנחי, יחד עם נוקלאז Cas9, משולב ליצירת קומפלקסים של ריבונוקלאו פרוטאין (RNP) המכוונים לרצפי דנ”א בעלי עניין בתוך הגנום וגורמים לשבירת DNA דו-גדילי. מכיוון שמנגנוני תיקון דנ”א תאי מועדים לשגיאות, החדרות ומחיקות (INDELs) מוכנסות במהלך תהליך התיקון שיכולות לשבש את תפקוד גן המטרה. כאשר יש העברה משותפת של רצף דנ”א מהונדס רצוי (תבנית תיקון) יחד עם ריאגנטים לעריכת גנום, החדרת תבנית התיקון באזור המכיל את שבירת הדנ”א הדו-גדילי מתרחשת בתהליך שנקרא תיקון מכוון הומולוגיה (HDR). זוהי אסטרטגיה יעילה ליצירת מודלים של בעלי חיים עם החדרות/החלפות ממוקדות של DNA (נוק-אין). מגבלה אחת היא שרצפי דפיקה הם לעתים קרובות גדולים בגודלם, מה שהוכח כמפחית את יעילות עריכת הגנים, ובכך מקשה על יצירת המודל הרצוי1. אסטרטגיות להגברת היעילות כללו ליניאריזציה של תבניות תיקון DNA דו-גדילי (dsDNA) ו-DNA חד-גדילי (ssDNA) ושינוי כימי של תבניות תיקון DNA 2,3,4. בנוסף, מיקרו-הזרקה פרו-גרעינית יחד עם תרכובות מעוררות HDR, יישום פולסים חשמליים בשילוב עם מיקרו-הזרקה, ומיקרו-הזרקה מתוזמנת לעוברים דו-תאיים נוסו כולם 5,6,7. למרות ההצלחה של כמה מגישות אלה, השילוב של רצפי DNA גדולים מ -1.0 קילובייט נותר מאתגר מבחינה טכנית.
אלקטרופורציה, שהיא שיטה נפוצה להחדרת ריאגנטים לקווי תאים בתרבית, מציעה חלופה למיקרו-הזרקה להעברת רכיבי CRISPR-Cas9 לעוברים. אלקטרופורציה עוברית, שהודגמה לראשונה בעוברי חולדות8, שימשה מאז בהצלחה כשיטת לידה בעכברים 9,10,11,12,13, חזירים 14,15 ואורגניזמים אחרים מודל של בעלי חיים 16,17,18. עוברים, המרחפים בתווך המכיל ריאגנטים מסוג CRISPR-Cas9, מוכנסים לקובט או למגלשת זכוכית בין שתי אלקטרודות ונתונים לפולסים ישירים של זרמים חשמליים. זה יוצר פתחים חולפים בזונה פלוצ’ידה ובקרום הפלזמה העוברית שדרכם רכיבי CRISPR-Cas9 נכנסים לעוברים. בדרך כלל, פולסי “נקבוביות” חשמליים ברמה בינונית משמשים ליצירת הפתחים הזמניים ולאחריהם “פולסי העברה” חשמליים ברמה נמוכה יותר המאפשרים תנועה של רכיבי עריכת הגנום הטעונים שלילית. אלקטרופורציה של עוברים היא יעילה, בעלת תפוקה גבוהה וקלה לביצוע. עם זאת, בעוד אלקטרופורציה של עוברים הוכחה כמוצלחת מאוד עבור הצגת תבניות תיקון ssDNA קטנות (<200 bp), ישנם דיווחים מעטים על אלקטרופורציה מוצלחת של תבניות תיקון גדולות יותר (>1.0 kb)13,19. מגבלת גודל זו מייצגת מגבלה גדולה של אלקטרופורציה של עוברים ליצירת מודלים של בעלי חיים הדורשים החדרות גדולות.
בהקשר של ריפוי גנטי, וירוסים הקשורים באדנו (AAVs) שימשו זה מכבר ככלי להעברת חומר גנטי בשל יעילותם בהדבקה in vivo של תאים מתחלקים ולא מתחלקים, חוסר פתוגניות, ואינטגרציה גנומית נדירה20,21. לאחרונה, מחקרים נוספים שילבו AAVs עם טכנולוגיית CRISPR-Cas9 כדי להציג תבניות תיקון DNA וריאגנטים CRISPR 22,23,24. גישה זו מאפשרת משלוח של תבניות תיקון DNA גדולות יותר ללא צורך בטכניקות מיקרו-הזרקה.
מסלול HDR פעיל יותר בשלבים המאוחרים של S ו- G2 של מחזור התא25,26. במחקרים שבוצעו במבחנה, עליות משמעותיות ביעילות הדפיקה הושגו על ידי העברת CRISPR-Cas9 RNPs ותבניות תיקון DNA לתאים מסונכרנים G2 או על ידי הגבלת נוכחות חלבון Cas9 לשלבים מאוחרים של S ו- G2 באמצעות חלבון היתוך Cas9-Geminin2. יתר על כן, יש אירוע גדול של הפעלת גנום זיגוטי (ZGA) המתרחש במהלך שלב G2 המורחב של העובר בשלב 2 תאים, וזה קשור למצב כרומטין פתוח. משערים כי הדבר מספק ל-CRISPR-Cas9 RNPs ולתבניות תיקון נגישות רבה יותר לדנ”א הגנומי.
מטרתנו הייתה להתבסס על כל התצפיות הללו, על ידי שילוב גישת AAV עם אלקטרופורציה של עוברים כדי להציג CRISPR-Cas9 RNPs בשלב 2 התאים של התפתחות העובר. אסטרטגיה זו מנצלת את יכולת המסירה הגדולה יותר של תבנית תיקון DNA של AAV, את הקלות הטכנית של אלקטרופורציה ואת נקודת הזמן האופטימלית יותר של 2 תאים לנגישות גנומית במהלך התפתחות העובר כדי ליצור שיטה יעילה להנדסה גנטית ממוקדת של החדרות DNA. כפי שמודגש בפרוטוקול זה, השיטה האופטימלית שלנו מאפשרת ייצור של מודלים ממוקדים של חולדות הנושאות החדרות של רצפי DNA בגודל של 1.2 עד 3.0 קילובייט ללא צורך בטכניקות מיקרו-הזרקה.
Protocol
Representative Results
Discussion
מערכת עריכת הגנום CRISPR-Cas חוללה מהפכה בתחום ההנדסה הגנטית בכך שאפשרה ייצור יעיל של שינויים גנטיים פשוטים ומורכבים בהתאמה אישית במגוון מיני בעלי חיים. שכלולים תכופים ושיפורים בטכניקות הקשורות לעריכת גנום מגבירים את הרבגוניות שלו. כאן תיארנו גישה חדשה המשתמשת בהעברת DNA בתיווך ssAAV יחד עם אלקט…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות לנולאן דייוויס על הסיוע בצילום וידאו ובעריכת וידאו.
Materials
| Leads with alligator clips for electrodes | NepaGene | C117 | |
| Mineral oil | MilliporeSigma | M5310 | |
| NepaGene21 Super Electroporator | NepaGene | NEPA21 | |
| Platinum plate electrodes on slide glass | NepaGene | CUY501P1-1.5 | |
| PURedit Cas9 Protein | MilliporeSigma | PECAS9 | |
| sgRNA (chemically-modified) | Synthego | N/A | |
| ssAAV1 or ssAAV6 packaged DNA repair template | Vectorbuilder | N/A |
References
- Lau, C. H., Tin, C., Suh, Y. CRISPR-based strategies for targeted transgene knock-in and gene correction. Fac Rev. 9, 20 (2020).
- Gutschner, T., Haemmerle, M., Genovese, G., Draetta, G. F., Chin, L. Post-translational Regulation of Cas9 during G1 Enhances Homology-Directed Repair. Cell Rep. 14 (6), 1555-1566 (2016).
- Zhang, J. P., et al. Efficient precise knockin with a double cut HDR donor after CRISPR/Cas9-mediated double-stranded DNA cleavage. Genome Biol. 18 (1), 35 (2017).
- Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knockout mouse models using long ssDNA donors. Nat Protoc. 13 (1), 195-215 (2018).
- Gu, B., Posfai, E., Gertsenstein, M., Rossant, J. Efficient generation of large-fragment knock-in mouse models using 2-cell (2C)-homologous recombination (HR)-CRISPR. Curr Protoc Mouse Biol. 10 (1), e67 (2020).
- Gu, B., Posfai, E., Rossant, J. Efficient generation of targeted large insertions by microinjection into two-cell-stage mouse embryos. Nat Biotechnol. 36 (7), 632-637 (2018).
- Kurihara, T., et al. DNA repair protein RAD51 enhances the CRISPR/Cas9-mediated knock-in efficiency in brain neurons. Biochem Biophys Res Commun. 524 (3), 621-628 (2020).
- Kaneko, T., Sakuma, T., Yamamoto, T., Mashimo, T. Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos. Sci Rep. 4, 6382 (2014).
- Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y., Modzelewski, A. J., He, L. Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes. J Biol Chem. 291 (28), 14457-14467 (2016).
- Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse. Dev Biol. 418 (1), 1-9 (2016).
- Wang, W., et al. Delivery of Cas9 protein into mouse zygotes through a series of electroporation dramatically increases the efficiency of model creation. J Genet Genomics. 43 (5), 319-327 (2016).
- Troder, S. E., et al. An optimized electroporation approach for efficient CRISPR/Cas9 genome editing in murine zygotes. PLoS One. 13 (5), e0196891 (2018).
- Teixeira, M., et al. Electroporation of mice zygotes with dual guide RNA/Cas9 complexes for simple and efficient cloning-free genome editing. Sci Rep. 8 (1), 474 (2018).
- Tanihara, F., et al. Efficient generation of GGTA1-deficient pigs by electroporation of the CRISPR/Cas9 system into in vitro-fertilized zygotes. BMC Biotechnol. 20 (1), 40 (2020).
- Tanihara, F., et al. Generation of CD163-edited pig via electroporation of the CRISPR/Cas9 system into porcine in vitro-fertilized zygotes. Anim Biotechnol. 32 (2), 147-154 (2021).
- Camargo, L. S. A., Owen, J. R., Van Eenennaam, A. L., Ross, P. J. Efficient one-step knockout by electroporation of ribonucleoproteins into zona-intact bovine embryos. Front Genet. 11, 570069 (2020).
- Lin, J. C., Van Eenennaam, A. L. Electroporation-mediated genome editing of livestock zygotes. Front Genet. 12, 648482 (2021).
- Betters, E., Charney, R. M., Garcia-Castro, M. I. Electroporation and in vitro culture of early rabbit embryos. Data Brief. 21, 316-320 (2018).
- Miyasaka, Y., et al. CLICK: one-step generation of conditional knockout mice. BMC Genomics. 19 (1), 318 (2018).
- Epstein, B. E., Schaffer, D. V. Combining engineered nucleases with adeno-associated viral vectors for therapeutic gene editing. Adv Exp Med Biol. 1016, 29-42 (2017).
- Gaj, T., Epstein, B. E., Schaffer, D. V. Genome engineering using adeno-associated virus: basic and clinical research applications. Mol Ther. 24 (3), 458-464 (2016).
- Chen, S., et al. CRISPR-READI: Efficient generation of knockin mice by CRISPR RNP electroporation and AAV donor infection. Cell Rep. 27 (13), 3780-3789 (2019).
- Mizuno, N., et al. Intra-embryo gene cassette knockin by CRISPR/CAS9-mediated genome editing with adeno-associated viral vector. iScience. 9, 286-297 (2018).
- Davis, D. J., et al. Efficient DNA knock-in using AAV-mediated delivery with 2-cell embryo CRISPR-Cas9 electroporation. Front Genome Ed. 5, 1256451 (2023).
- Smirnikhina, S. A., Zaynitdinova, M. I., Sergeeva, V. A., Lavrov, A. V. Improving homology-directed repair in genome editing experiments by influencing the cell cycle. Int J Mol Sci. 23 (11), (2022).
- Takata, M., et al. Homologous recombination and non-homologous end-joining pathways of DNA double-strand break repair have overlapping roles in the maintenance of chromosomal integrity in vertebrate cells. EMBO J. 17 (18), 5497-5508 (1998).
- Men, H., Stone, B. J., Bryda, E. C. Media optimization to promote rat embryonic development to the blastocyst stage in vitro. Theriogenology. 151, 81-85 (2020).
- Men, H., Amos-Landgraf, J. M., Bryda, E. C., Franklin, C. L. KSOM-R supports both mouse and rat preimplantation embryo development in vitro. Theriogenology. 198, 69-74 (2023).
- Romeo, C., et al. AAV diffuses across zona pellucida for effortless gene delivery to fertilized eggs. Biochem Biophys Res Commun. 526 (1), 85-90 (2020).
- Fulka, J., Moor, R. M., Fulka, J. Electrofusion of mammalian oocytes and embryonic cells. Methods Mol Biol. 48, 309-316 (1995).
- Rems, L., et al. Cell electrofusion using nanosecond electric pulses. Sci Rep. 3, 3382 (2013).
