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Cancer Research

कैंसर के रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड मॉडल में दवा प्रतिक्रियाओं के लिए मल्टीप्लेक्स लाइव-सेल इमेजिंग

Published: January 5, 2024 doi: 10.3791/66072
Automatic Translation
*1,2, *1, *3, 1, 1, 1,4, 1, 1, 5, 6, 3, 1,7
1Department of Obstetrics and Gynecology, Carver College of Medicine, University of Iowa, 2Cancer Biology Graduate Program, Carver College of Medicine, University of Iowa, 3The Institute of Cancer Research: and the Royal Marsden NHS Foundation Trust, 4Department of Radiation Oncology, Carver College of Medicine, University of Iowa, 5Division of Molecular Medicine, Departments of Internal Medicine and Obstetrics and Gynecology, University of New Mexico Comprehensive Cancer Center, University of New Mexico Health Sciences Center, 6Agilent Technologies, 7Holden Comprehensive Cancer Center, University of Iowa
* These authors contributed equally

Summary

रोगी-व्युत्पन्न ट्यूमर ऑर्गेनोइड बुनियादी और अनुवाद संबंधी अनुसंधान के लिए एक परिष्कृत मॉडल प्रणाली है। इस विधि लेख विभिन्न ऑर्गेनॉइड फेनोटाइप के एक साथ गतिज मूल्यांकन के लिए मल्टीप्लेक्स फ्लोरोसेंट लाइव-सेल इमेजिंग के उपयोग का विवरण देता है।

Abstract

कैंसर के रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड (पीडीओ) मॉडल एक बहुक्रियाशील अनुसंधान प्रणाली है जो कैंसर सेल लाइनों की तुलना में मानव रोग को बेहतर ढंग से पुन: व्यवस्थित करता है। पीडीओ मॉडल बाह्य तहखाने झिल्ली अर्क (बीएमई) में रोगी ट्यूमर कोशिकाओं संवर्धन और उन्हें तीन आयामी गुंबदों के रूप में चढ़ाना द्वारा उत्पन्न किया जा सकता है। हालांकि, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अभिकर्मक जिन्हें मोनोलेयर संस्कृतियों में फेनोटाइपिक परख के लिए अनुकूलित किया गया है, अक्सर बीएमई के साथ संगत नहीं होते हैं। इसमें, हम पीडीओ मॉडल प्लेट और एक स्वचालित लाइव-सेल इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके दवा प्रभावों का आकलन करने के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं। इसके अलावा, हम फ्लोरोसेंट रंगों को लागू करते हैं जो सेल स्वास्थ्य और एपोप्टोसिस को एक साथ निर्धारित करने के लिए गतिज माप के साथ संगत होते हैं। छवि कैप्चर को कई दिनों में नियमित समय अंतराल पर होने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। उपयोगकर्ता व्यक्तिगत जेड-प्लेन छवियों में दवा के प्रभाव या कई फोकल विमानों से धारावाहिक छवियों के जेड प्रोजेक्शन का विश्लेषण कर सकते हैं। मास्किंग का उपयोग करके, ब्याज के विशिष्ट मापदंडों की गणना की जाती है, जैसे पीडीओ संख्या, क्षेत्र और प्रतिदीप्ति तीव्रता। हम सेल स्वास्थ्य, एपोप्टोसिस और व्यवहार्यता पर साइटोटोक्सिक एजेंटों के प्रभाव का प्रदर्शन करने वाले प्रूफ-ऑफ-कॉन्सेप्ट डेटा प्रदान करते हैं। इस स्वचालित गतिज इमेजिंग प्लेटफॉर्म को कैंसर के पीडीओ मॉडल में विविध चिकित्सीय प्रभावों को समझने के लिए अन्य फेनोटाइपिक रीडआउट तक विस्तारित किया जा सकता है।

Introduction

रोगी-व्युत्पन्न ट्यूमर ऑर्गेनोइड (पीडीओ) तेजी से कैंसर के विकास और चिकित्सीय प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक मजबूत मॉडल प्रणाली के रूप में उभर रहे हैं। पीडीओ तीन आयामी (3 डी) सेल संस्कृति प्रणाली है कि जटिल जीनोमिक प्रोफ़ाइल और प्राथमिक ट्यूमर 1,2 की वास्तुकला पुनरावृत्ति कर रहे हैं. अमर कैंसर सेल लाइनों के पारंपरिक दो आयामी (2 डी) संस्कृतियों के विपरीत, पीडीओ पर कब्जा और intratumoral विषमता 3,4 बनाए रखने, उन्हें यंत्रवत और अनुवाद अनुसंधान दोनों के लिए एक मूल्यवान उपकरण बनाने. हालांकि पीडीओ एक तेजी से लोकप्रिय मॉडल प्रणाली बन रहे हैं, पीडीओ संस्कृतियों के साथ संगत सेलुलर प्रभावों के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अभिकर्मकों और विश्लेषण विधियों सीमित हैं।

उपचार प्रतिक्रिया में सूक्ष्म परिवर्तनों का विश्लेषण करने के लिए मजबूत तरीकों की कमी नैदानिक अनुवाद में बाधा डालती है। 3 डी संस्कृतियों में स्वर्ण मानक सेल स्वास्थ्य अभिकर्मक, सेलटिटर-ग्लो 3 डी, सेल व्यवहार्यता 5,6 के निर्धारक के रूप में एटीपी स्तरों का उपयोग करता है। जबकि यह अभिकर्मक समापन बिंदु परख के लिए उपयोगी है, कई चेतावनी हैं, विशेष रूप से परख के पूरा होने के बाद अन्य उद्देश्यों के लिए नमूनों का उपयोग करने में असमर्थता।

लाइव-सेल इमेजिंग गतिज माइक्रोस्कोपी का एक परिष्कृत रूप है, जो फ्लोरोसेंट अभिकर्मकों के साथ संयुक्त होने पर, एपोप्टोसिस 7,8,9 और साइटोटॉक्सिसिटी10सहित पीडीओ मॉडल के भीतर विभिन्न प्रकार के सेल स्वास्थ्य रीडआउट की मात्रा निर्धारित करने की क्षमता रखता है। दरअसल, लाइव सेल इमेजिंग 2 डी प्लेटफार्मों11,12 में यौगिकों के उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग के अभिन्न अंग किया गया है. Incucyte जैसी प्रणालियों ने प्रौद्योगिकी को सस्ती बना दिया है और इस प्रकार विभिन्न सेटिंग्स में अनुसंधान समूहों के लिए सुलभ है। हालांकि, 3 डी संस्कृतियों का विश्लेषण करने के लिए इन प्रणालियों का अनुप्रयोग अभी भी अपनी प्रारंभिक अवस्था में है।

इसमें, हम मल्टीप्लेक्स लाइव-सेल इमेजिंग(चित्रा 1)का उपयोग करके कैंसर के पीडीओ मॉडल में दवा प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं। उज्ज्वल क्षेत्र छवियों के विश्लेषण के माध्यम से, पीडीओ आकार और आकृति विज्ञान में परिवर्तन की गतिज निगरानी की जा सकती है। इसके अलावा, सेलुलर प्रक्रियाओं को फ्लोरोसेंट अभिकर्मकों का उपयोग करके समय के साथ एक साथ मात्रा निर्धारित की जा सकती है, जैसे एपोप्टोसिस के लिए एनेक्सिन वी रेड डाई और साइटोटॉक्सिसिटी के लिए साइटोटॉक्स ग्रीन डाई। प्रस्तुत विधियों Cytation 5 लाइव-सेल इमेजिंग सिस्टम के लिए अनुकूलित हैं, लेकिन इस प्रोटोकॉल को विभिन्न लाइव-सेल इमेजिंग प्लेटफार्मों में अनुकूलित किया जा सकता है।

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Protocol

मानव ट्यूमर नमूनों का उपयोग कर अध्ययन की समीक्षा की और आयोवा संस्थागत समीक्षा बोर्ड विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया (आईआरबी), प्रोटोकॉल #201809807, और नैतिक मानकों के अनुसार प्रदर्शन के रूप में में निर्धारित 1964 हेलसिंकी घोषणा और इसके बाद के संशोधनों. अध्ययन में भाग लेने वाले सभी विषयों से सूचित सहमति प्राप्त की गई थी। समावेशन मानदंड में कैंसर का निदान और ट्यूमर नमूनों की उपलब्धता शामिल है।

1. एक 96 अच्छी तरह से थाली में बरकरार पीडीओ चढ़ाना

  1. अभिकर्मकों को तैयार करें।
    1. रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर 96-अच्छी प्लेटों को प्रीहीट करें और रात भर बीएमई को 4 डिग्री सेल्सियस पर पिघलाएं।
    2. ब्याज के कैंसर प्रकार संवर्धन के लिए अनुकूलित पूर्ण organoid संस्कृति मीडिया तैयार करें। यहां दिखाए गए प्रयोगों के लिए उपयोग किए जाने वाले विशिष्ट संस्कृति मीडिया पूरक तालिका 1में प्रदान किए गए हैं।
      नोट: मीडिया घटकों को विभिन्न ट्यूमर प्रकारों के लिए संशोधित करने की आवश्यकता हो सकती है। उदाहरण के लिए, organoid संस्कृति मीडिया स्त्री रोग संबंधी ट्यूमर13 के लिए 100 एनएम एस्ट्राडियोल के साथ पूरक है. तैयार मीडिया 1 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर है। लंबी अवधि के भंडारण के लिए, 50 एमएल ट्यूबों में मीडिया विभाज्य और -20 डिग्री सेल्सियस पर दुकान.
  2. 4 डिग्री सेल्सियस और 37 डिग्री सेल्सियस पर ऑर्गेनॉइड कल्चर मीडिया के दो अलग-अलग एलिकोट तैयार करें। उदाहरण के लिए, यदि 60 कुओं को 96-अच्छी तरह से प्लेट में चढ़ाया जा रहा है, तो गर्म ऑर्गेनॉइड कल्चर मीडिया के 6 एमएल और बर्फ-ठंडे ऑर्गेनॉइड कल्चर मीडिया के 150 माइक्रोन का उपयोग करें।
  3. ऑर्गेनॉइड वॉश बफर तैयार करें: 10 एमएम एचईपीईएस, 1x ग्लूटामैक्स, 5 एमएम ईडीटीए और 10 माइक्रोन वाई-27632 के साथ 1x पीबीएस को पूरक करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें
  4. हार्वेस्ट पीडीओ एक 24 अच्छी तरह से थाली में सुसंस्कृत. बर्फ पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर सभी कदम करें जब तक कि अन्यथा उल्लेख न किया गया हो।
    1. एक वैक्यूम लाइन प्रणाली का उपयोग कर प्रत्येक अच्छी तरह से मीडिया महाप्राण.
    2. बर्फ-ठंडे ऑर्गेनॉइड वॉश बफर के 500 माइक्रोन जोड़ें और धीरे-धीरे 1000 माइक्रोन पिपेटर का उपयोग करके 2-3x विंदुक करें। 10 मिनट के लिए बर्फ पर थाली सेते हैं.
    3. प्रत्येक अच्छी तरह से एक 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब के लिए सामग्री स्थानांतरण. यह सुनिश्चित करने के लिए कि सभी पीडीओ निलंबन में हैं, ऑर्गेनॉइड वॉश बफर के अतिरिक्त 300 माइक्रोन के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से कुल्ला, और 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 350 x ग्राम पर 5 मिन के लिए अपकेंद्रित्र
    4. एक वैक्यूम लाइन प्रणाली का उपयोग करके बीएमई/ऑर्गेनॉइड गोली से सतह पर तैरनेवाला को महाप्राण करें, ट्यूब में ~ 5 एमएल शेष छोड़ दें। ऑर्गेनॉइड वॉश बफर के 20 एमएल जोड़ें और धीरे से 10 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके गोली को फिर से निलंबित करें। 10 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं.
    5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 350 x ग्राम पर 5 मिन के लिए अपकेंद्रित्र। एक वैक्यूम लाइन प्रणाली के साथ सतह पर तैरनेवाला महाप्राण, पीडीओ गोली को बाधित नहीं करने के लिए ध्यान रखना.
  5. एक 96 अच्छी तरह से थाली में चढ़ाना पीडीओ: बर्फ पर सभी कदम प्रदर्शन जब तक अन्यथा उल्लेख किया.
    1. पीडीओ निलंबन बनाने के लिए बर्फ-ठंडे ऑर्गेनॉइड कल्चर मीडिया की उचित मात्रा में पीडीओ गोली को फिर से निलंबित करें। पीडीओ निलंबन को बर्फ-ठंडा 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
      नोट: ऑर्गेनॉइड कल्चर मीडिया की मात्रा की गणना करने के लिए, 96-वेल प्लेट में चढ़ाए जाने वाले कुओं की संख्या निर्धारित करें, यह ध्यान में रखते हुए कि पीडीओ ऑर्गेनॉइड कल्चर मीडिया और बीएमई के 1: 1 अनुपात में 5 माइक्रोन गुंबद में चढ़ाया जाता है। उदाहरण के लिए, जब एक 96-अच्छी प्लेट चढ़ाना और केवल आंतरिक 60 कुओं का उपयोग करना, पीडीओ निलंबन की कुल मात्रा 300 माइक्रोन होगी: 150 माइक्रोन ऑर्गेनॉइड कल्चर मीडिया और 150 माइक्रोन बीएमई। बीएमई के विभिन्न प्रतिशत पर इष्टतम वृद्धि प्रदर्शित करने वाले मॉडलों के लिए, बीएमई: मीडिया के अनुपात को इस चरण में संशोधित किया जा सकता है, हालांकि प्रत्येक विशिष्ट मॉडल के लिए सभी परखों में अनुपात को मानकीकृत करना महत्वपूर्ण है। पाइपिंग त्रुटि के लिए खाते में, प्रत्येक घटक में 10% मात्रा जोड़ें।
    2. पीडीओ की संख्या गिनें।
      1. पीडीओ निलंबन के 2.5 माइक्रोन को बर्फ-ठंडा 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और बीएमई के 2.5 माइक्रोन के साथ मिलाएं। एक साफ ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड पर 5 माइक्रोन मिश्रण स्थानांतरण. स्लाइड को कवर न करें। मिश्रण एक गुंबद में जम जाएगा।
      2. 4x पर एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप का उपयोग कल्पना करें। 5 माइक्रोन मिश्रण में पीडीओ की संख्या की गणना करें; लक्ष्य 5 माइक्रोन गुंबद प्रति लगभग 25-50 पीडीओ है।
        नोट: यदि वांछित घनत्व परीक्षण मिश्रण में प्राप्त नहीं किया जाता है, तो पीडीओ निलंबन की अंतिम मात्रा को या तो अधिक ऑर्गेनॉइड कल्चर मीडिया जोड़कर या पीडीओ निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करके और बर्फ-ठंडे ऑर्गेनॉइड कल्चर मीडिया की कम मात्रा में पीडीओ गोली को निलंबित करके समायोजित करें। भले ही इस चरण में पीडीओ निलंबन को कैसे संशोधित किया गया हो, बीएमई का अंतिम अनुपात: चरण 1.5.3 में पीडीओ निलंबन। 1:1 होना चाहिए।
    3. विस्तृत बोर युक्तियों के साथ 200 माइक्रोन पिपेटेटर का उपयोग करके, बीएमई को ऑर्गेनॉइड कल्चर मीडिया के 1: 1 अनुपात को प्राप्त करने के लिए बीएमई की समान मात्रा के साथ पीडीओ निलंबन को ध्यान से मिलाएं। बुलबुले से बचें, जो गुंबदों की अखंडता को बाधित करेगा।
    4. 20 माइक्रोन पिपेटर का उपयोग करके, बीज 5 माइक्रोन गुंबदों को प्रीवार्म्ड 96-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं के केंद्र में, केवल आंतरिक 60 कुओं को बोया जाता है। पीडीओ के बराबर वितरण सुनिश्चित करने के लिए, समय-समय पर चौड़े बोर सुझावों के साथ 200 माइक्रोन पिपेटेटर के साथ 1.5 एमएल ट्यूब की सामग्री को पाइप करें।
    5. सभी कुओं बोया गया है के बाद, थाली पर ढक्कन जगह और धीरे पलटना. गुंबदों को जमने की अनुमति देने के लिए टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में 20 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर उलटा प्लेट इनक्यूबेट करें।
      नोट: प्लेट को उलटना यह सुनिश्चित करता है कि बीएमई / ऑर्गेनॉइड कल्चर मीडिया गुंबद पीडीओ गठन के लिए पर्याप्त जगह प्रदान करने के लिए 3 डी संरचना को बरकरार रखता है।
    6. प्लेट को पलटें ताकि यह ढक्कन के साथ बैठा हो और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए इनक्यूबेट हो।

2. उपचार और मल्टीप्लेक्सिंग के लिए फ्लोरोसेंट रंगों के अलावा

  1. जबकि बीएमई गुंबद 96 अच्छी तरह से प्लेटों में जम रहे हैं, फ्लोरोसेंट लाइव सेल इमेजिंग अभिकर्मकों के कमजोर पड़ने को तैयार. मल्टीप्लेक्सिंग एनेक्सिन वी रेड डाई और साइटोटॉक्स ग्रीन डाई के लिए विशिष्ट पैरामीटर यहां दिए गए हैं।
  2. फ्लोरोसेंट अभिकर्मक तैयारी (दिन -1): इलाज किए जाने वाले कुओं की संख्या के आधार पर ऑर्गेनॉइड कल्चर मीडिया की उचित मात्रा की गणना करें, यह मानते हुए कि प्रत्येक अच्छी तरह से डाई-खुराक वाले मीडिया के 100 माइक्रोन के साथ इलाज किया जाएगा। वांछित एकाग्रता के लिए पूर्व गर्म organoid संस्कृति मीडिया में डाई पतला.
    नोट: मीडिया की जरूरत की कुल राशि प्रयोग के आधार पर अलग अलग होंगे. पाइपिंग त्रुटि के लिए खाते में अंतिम मात्रा में 10% जोड़ें। उदाहरण के लिए, एक 96 अच्छी तरह से थाली के भीतरी 60 कुओं का इलाज करने के लिए, डाई-खुराक मीडिया (तालिका 1) के 6.6 एमएल तैयार करते हैं।
  3. 2x डाई-खुराक वाले ऑर्गेनॉइड कल्चर मीडिया के 100 माइक्रोन के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से इलाज करें। प्लेट के बाहरी खाली कुओं में बाँझ 1x पीबीएस के 200 माइक्रोन जोड़ें। रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    नोट: परिधीय कुओं में पीबीएस आंतरिक कुओं से मीडिया के वाष्पीकरण कम हो जाती है.
  4. दवाओं/उपचार एजेंटों का जोड़ (दिन 0): प्रति कुएं 100 माइक्रोन की मात्रा में 2x एकाग्रता पर पूर्व-गर्म ऑर्गेनॉइड कल्चर मीडिया में दवाएं तैयार करें।
    नोट: डीएमएसओ उच्च सांद्रता में कोशिकाओं के लिए विषाक्त हो सकता है। इस अध्ययन में किए गए प्रयोगों में 0.1% डीएमएसओ की एकाग्रता से अधिक नहीं है। दवाओं के अलावा, कुछ फ्लोरोसेंट अभिकर्मकों को डीएमएसओ समाधान के रूप में वितरित किया जाता है। ऐसे अभिकर्मकों के साथ काम करते समय कुल डीएमएसओ एकाग्रता का हिसाब रखना महत्वपूर्ण है।
  5. प्रत्येक अच्छी तरह से 2x डाई-खुराक वाले मीडिया के 100 माइक्रोन जोड़ें; बुलबुले बनाने से बचें।

3. इमेजिंग पैरामीटर सेट करना

  1. साइटेशन में प्लेट रखें 5. खोलना Gen5 सॉफ्टवेयर। इमेजर मैनुअल मोड > नया टास्क पर क्लिक करें। अभी कैप्चर करें चुनें और निम्नलिखित सेटिंग्स इनपुट करें: उद्देश्य (वांछित आवर्धन का चयन करें); फ़िल्टर (माइक्रोप्लेट का चयन करें); माइक्रोप्लेट प्रारूप (कुओं की संख्या का चयन करें); और पोत प्रकार (प्लेट प्रकार का चयन करें)। ढक्कन का उपयोग करें और धीमी वाहक गति का उपयोग करें पर क्लिक करें। ओके पर क्लिक करें।
    नोट: पोत प्रकार: प्लेट के बारे में जानकारी का चयन करते समय जितना संभव हो उतना विशिष्ट रहें क्योंकि सॉफ्टवेयर प्रत्येक प्लेट प्रकार और प्लास्टिक की मोटाई के लिए उद्देश्य से प्लेट के नीचे तक विशिष्ट दूरी पर कैलिब्रेट किया जाता है।
    धीमी वाहक गति: प्लेटों को लोड/अनलोड करते समय गुंबदों को बाधित करने से बचने के लिए इस बॉक्स का चयन करें।
  2. एक जेड-स्टैक बनाएं जो पूरे बीएमई गुंबद की छवि देगा।
    1. देखने के लिए रुचि का एक कुआं चुनें (बाएं पैनल, हिस्टोग्राम के नीचे)।
    2. ब्राइट फ़ील्ड चैनल (बायां पैनल, शीर्ष) चुनें। स्वतः उजागर करें पर क्लिक करें और आवश्यकतानुसार सेटिंग्स समायोजित करें.
    3. Z-Stack के नीचे और ऊपर सेट करें: इमेजिंग मोड टैब (बायाँ पैनल, मध्य) विस्तृत करें। जेड-स्टैक बॉक्स को चेक करें। पाठ्यक्रम समायोजन तीर (बाएं पैनल, मध्य) का उपयोग करके, नीचे समायोजन पर क्लिक करें जब तक कि सभी पीडीओ अंदर न आ जाएं और फिर फोकस से बाहर न हों और फजी हों। इसे Z-Stack के नीचे सेट करें। Z-स्टैक के शीर्ष को सेट करने के लिए पाठ्यक्रम समायोजन तीरों का उपयोग करके विपरीत दिशा में दोहराएं।
    4. यह सुनिश्चित करने के लिए कि जेड-स्टैक सेटिंग्स ब्याज के अन्य कुओं के लिए उपयुक्त हैं, एक और अच्छी तरह से (बाएं पैनल, हिस्टोग्राम के नीचे) का चयन करें और जेड-स्टैक के ऊपर और नीचे की कल्पना करें।
    5. मैन्युअल रूप से फोकल स्थिति दर्ज करने के लिए, ठीक समायोजन (बाएं पैनल, शीर्ष) के बगल में तीन बिंदुओं पर क्लिक करें। एक विंडो खुलेगी; शीर्ष जेड-स्टैक मान में टाइप करें ( इमेजिंग मोड के तहत बाएं पैनल, केंद्र में पाया जाता है)। नीचे Z-Stack मान के लिए दोहराएं। चरण 3.2.3 को दोहराकर वांछित Z रेंज को कैप्चर करने के लिए आवश्यकतानुसार समायोजित करें। यदि समायोजन आवश्यक थे, तो सेटिंग्स को सत्यापित करने के लिए एक और अच्छी तरह से चुनें।
  3. फ्लोरोसेंट चैनल (ओं) के लिए जोखिम सेटिंग्स सेट करें. सेटिंग्स दो फ्लोरोसेंट चैनलों (GFP और TRITC) के लिए वर्णित हैं. फ्लोरोसेंट चैनलों की विशिष्ट संख्या प्रयोग पर निर्भर करेगी और जो फ्लोरोसेंट क्यूब्स लाइव-सेल इमेजिंग सिस्टम में स्थापित हैं।
    नोट: संकेत तीव्रता प्रयोग के अंत में काफी अधिक होने का अनुमान है, तो उपयोगकर्ताओं को प्रयोग के अंत में इष्टतम जोखिम सेटिंग्स है कि तो प्रारंभिक मापदंडों की स्थापना जब लागू किया जा सकता है निर्धारित करने के लिए परीक्षण प्रयोगों प्रदर्शन पर विचार करना चाहिए.
    1. इमेजिंग मोड टैब (बाएं पैनल, मध्य) का विस्तार करें और इमेजिंग चरण संपादित करें खोलें। एक पॉप-अप विंडो दिखाई देगी।
    2. चैनल के अंतर्गत, चैनलों की वांछित संख्या के लिए बबल पर क्लिक करें। उज्ज्वल क्षेत्र के लिए एक चैनल और प्रत्येक फ्लोरोसेंट चैनल के लिए अतिरिक्त चैनल नामित करें। इस उदाहरण में, चैनल 1 = ब्राइट फ़ील्ड; चैनल 2 = जीएफपी; चैनल 3 = TRITC। ड्रॉप-डाउन रंग मेनू का उपयोग करके, प्रत्येक चैनल के लिए उपयुक्त सेटिंग का चयन करें। ठीक क्लिक करके संपादन विंडो बंद करें.
    3. प्रत्येक फ्लोरोसेंट चैनल सेट करें।
      1. चैनल को GFP (बाएं पैनल, शीर्ष) पर स्विच करें।
      2. ऑटो-एक्सपोज़ (बायां पैनल, शीर्ष) पर क्लिक करें। एक्सपोज़र टैब (बायाँ पैनल, मध्य) का विस्तार करें और पृष्ठभूमि संकेत को कम करने के लिए एक्सपोज़र सेटिंग्स को समायोजित करें।
      3. एक्सपोज़र सेटिंग्स को छवि मोड टैब पर चरण 3.3.3.3-3.3.3.6 का पालन करते हुए कॉपी करें।
      4. इमेजिंग चरण संपादित करें बॉक्स के आगे कॉपी आइकन पर क्लिक करें। इमेजिंग चरण संपादित करें पर क्लिक करें, जो एक और विंडो खोलेगा।
      5. GFP चैनल के अंतर्गत, चैनल में रोशनी, एकीकरण समय और कैमरा लाभ सेटिंग्स जोड़ने के लिए एक्सपोज़र पंक्ति में क्लिपबोर्ड आइकन पर क्लिक करें।
      6. TRITC चैनल के लिए चरण 3.3.3.4-3.3.3.5 दोहराएं। विंडो बंद करने के लिए ठीक क्लिक करें।
  4. छवि प्रीप्रोसेसिंग को स्वचालित करने के लिए छवि प्रीप्रोसेसिंग और जेड-प्रोजेक्शन चरणों को सेट करें।
    1. कैमरा आइकन (बाएं पैनल, निचले कोने) पर क्लिक करें। एक नई विंडो खुलेगी।
    2. Add Processing Step (left panel, bottom) में, Image Preprocessing पर क्लिक करें। एक नई विंडो खुलेगी।
    3. ब्राइट फ़ील्ड टैब पर, छवि प्रीप्रोसेसिंग लागू करें को अचयनित करें।
    4. प्रत्येक फ्लोरोसेंट चैनल टैब के लिए, सुनिश्चित करें कि छवि प्रीप्रोसेसिंग लागू करें चयनित है। चैनल 1 के समान विकल्पों का उपयोग करें को अचयनित करें और ठीक क्लिक करें। खिड़की बंद हो जाएगी।
    5. Add Processing Step में, Z प्रोजेक्शन पर क्लिक करें। एक नई विंडो खुलेगी। यदि वांछित है, तो स्लाइस रेंज को समायोजित करें (उदाहरण के लिए, जेड रेंज को संकीर्ण करने के लिए)। ठीक का चयन करके विंडो बंद करें.
  5. प्रोटोकॉल बनाएँ।
    1. उपकरण पट्टी में छवि सेट पर क्लिक करें. ड्रॉप-डाउन मेनू में, इस चित्र सेट से प्रयोग बनाएं पर क्लिक करें. इमेजिंग विंडो बंद हो जाएगी, और प्रक्रिया विंडो खुल जाएगी।
      नोट: इमेजर मैनुअल मोड में चयनित पैरामीटर स्वचालित रूप से नई विंडो में लोड किए जाएंगे, जिससे एक प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल बनाया जा सकता है।
    2. तापमान और ग्रेडिएंट सेट करें : कार्रवाई शीर्षक (बाएं) के अंतर्गत तापमान सेट करें पर क्लिक करें। एक नई विंडो खुलेगी। इनक्यूबेटर ऑन का चयन करें और मैन्युअल रूप से तापमान के तहत वांछित तापमान दर्ज करें। अगला, ग्रेडिएंट के तहत, मैन्युअल रूप से 1 दर्ज करें। ठीक का चयन करके विंडो बंद करें.
      नोट: 1 डिग्री सेल्सियस ढाल बनाने से प्लेट के ढक्कन पर संघनन को बनने से रोका जा सकेगा।
    3. छवि के लिए कुओं को नामित करें।
      1. विवरण के तहत छवि चरण पर डबल-क्लिक करें। पूर्ण प्लेट (दायां कोना, शीर्ष) पर क्लिक करें। इससे Plate Layout विंडो खुल जाएगी।
      2. कर्सर का उपयोग करके ब्याज के कुओं को हाइलाइट करें। ओके पर क्लिक करें। यदि वांछित है, तो ऑटोफोकस बिनिंग और कैप्चर बिनिंग बॉक्स चेक करें। विंडो बंद करने के लिए ठीक क्लिक करें।
        नोट: बिनिंग को एक्सपोज़र समायोजन की आवश्यकता होगी, जैसा कि ऊपर चरण 3.3.3.2 में वर्णित है। कृपया उन विशिष्ट परिदृश्यों के लिए चर्चा अनुभाग देखें जिनमें इस सुविधा का उपयोग किया जा सकता है.
    4. गतिज इमेजिंग के लिए अंतराल सेट करें।
      1. अन्य शीर्षक (बाएं) के तहत विकल्प पर क्लिक करें। असंतत गतिज प्रक्रिया बॉक्स की जाँच करें।
      2. अनुमानित कुल समय के अंतर्गत, प्रयोग के लिए रन टाइम दर्ज करें (उदा., 5 दिन). अनुमानित अंतराल के तहत, प्लेट की छवि के लिए अंतराल दर्ज करें (उदाहरण के लिए, प्रत्येक 6 घंटे)।
      3. प्लेट इनक्यूबेटर में स्थानांतरित किया जा करने के लिए समय की अनुमति देने के लिए प्रत्येक रन के बाद रोकें क्लिक करें. ठीक का चयन करके विंडो बंद करें.
    5. डेटा कटौती चरणों को अपडेट करें।
      1. प्रक्रिया विंडो को बंद करने के लिए ठीक क्लिक करें। डेटा कटौती चरणों को अपडेट करने के लिए एक टैब खुलेगा। हाँ का चयन करें. Image Preprocessing पर डबल-क्लिक करें। सेटिंग्स सत्यापित करने के लिए विभिन्न चैनलों के माध्यम से क्लिक करें और ठीक क्लिक करें।
      2. Z प्रोजेक्शन पर डबल-क्लिक करें। सेटिंग की पुष्टि करने के लिए अलग-अलग चैनलों पर क्लिक करें. ओके पर क्लिक करें। फिर, डेटा कमी विंडो को बंद करने के लिए फिर से ठीक क्लिक करें।
    6. प्लेट लेआउट को प्रारूपित करें।
      1. प्लेट लेआउट विज़ार्ड खोलें और 3.6.2-3.6.3 चरणों का पालन करते हुए अच्छी तरह से प्रकार नामित करें।
      2. पर क्लिक करें प्लेट लेआउट टूलबार में आइकन (बाएं कोने, ऊपर) प्लेट लेआउट विज़ार्ड खोलने के लिए।
      3. प्रयोग में उपयोग किए जाने वाले अच्छी तरह से प्रकारों के बगल में स्थित बक्से की जांच करें। परख नियंत्रण के तहत, तीरों का उपयोग करके विभिन्न नियंत्रण प्रकारों की संख्या दर्ज करें। परख नियंत्रण #1 विंडो खोलने के लिए अगला क्लिक करें.
      4. परख नियंत्रण अच्छी तरह से चरणों 3.6.5-3.6.8 के बाद शर्तों सेट.
      5. परख नियंत्रण #1 विंडो पर, प्लेट लेआउट आईडी बॉक्स में नियंत्रण लेबल दर्ज करें। यदि वांछित है, तो आसन्न बॉक्स में पूरा नाम दर्ज करें। तीरों का उपयोग करके संबंधित नियंत्रण स्थिति के लिए प्रतिकृतियों की संख्या का चयन करें।
      6. यदि नियंत्रण के भीतर कई सांद्रता या कमजोर पड़ने वाली श्रृंखला का उपयोग कर रहे हैं, तो कमजोर पड़ने / सांद्रता को परिभाषित करें पर क्लिक करें और प्रकार का चयन करने के लिए ड्रॉप-डाउन मेनू का उपयोग करें। तालिका में प्रत्येक एकाग्रता / कमजोर पड़ने के लिए मान दर्ज करें।
        नोट: ऑटो फ़ंक्शन का उपयोग किया जा सकता है यदि सांद्रता लगातार वृद्धि से बदलती है।
      7. उपकरण पट्टी में रंग टैब का चयन करें. ड्रॉप-डाउन मेनू में नियंत्रण के लिए वांछित पाठ रंग और पृष्ठभूमि रंग चुनें। अगला पर क्लिक करें.
      8. अतिरिक्त नियंत्रणों के साथ आवश्यकतानुसार दोहराएं।
      9. 3.6.10-3.6.12 के बाद नमूना अच्छी तरह से शर्तों को सेट करें।
      10. नमूना सेटअप पृष्ठ पर, नमूना आईडी उपसर्ग (उदा., SPL) डालें. तीरों का उपयोग करके प्रतिकृतियों की संख्या का चयन करें। यदि अलग-अलग उपचार सांद्रता वाले नमूनों का उपयोग कर रहे हैं, तो प्रकार ड्रॉप-डाउन मेनू में सांद्रता या कमजोर पड़ने का चयन करें। तालिका में कमजोर पड़ने / सांद्रता दर्ज करें और यूनिट बॉक्स में इकाइयों को दर्ज करें।
      11. उपकरण पट्टी में पहचान फ़ील्ड का चयन करें. तालिका में वांछित श्रेणी नाम (ओं) (जैसे , नमूना आईडी, दवा) दर्ज करें।
      12. उपकरण पट्टी में रंग टैब का चयन करें. प्रत्येक उपचार समूह/नमूने के लिए एक अलग रंग चुनें। समाप्त करें पर क्लिक करें. इससे प्लेट लेआउट पेज खुल जाएगा।
        नोट: बाईं ओर की संख्याएं विभिन्न नमूना संख्याओं के साथ सहसंबंधित हैं।
      13. चरण 3.6.14-3.6.16 के बाद नमूना आईडी असाइन करें।
      14. चुनना बाएं पैनल से SPL1। कुओं का चयन करने के लिए कर्सर का उपयोग करें।
        नोट: स्वतः चयन उपकरण सीरियल असाइनमेंट बॉक्स में समायोजित किया जा सकता है। प्रतिकृतियों की संख्या और लेआउट के अभिविन्यास को पूर्व-नामित किया जा सकता है।
      15. प्लेट लेआउट को पूरा करने के लिए अन्य नमूनों के साथ दोहराएं। एक बार संतुष्ट होने पर, ओके पर क्लिक करें ।
      16. फ़ाइल उपकरण पट्टी में, नमूना ID का चयन करें. प्रत्येक नमूने के लिए उपयुक्त जानकारी के साथ नमूना आईडी कॉलम भरें (उदा., दवा का प्रकार). ओके दबाएं।
    7. प्रोटोकॉल सहेजें।
      1. उपकरण पट्टी में, फ़ाइल > प्रोटोकॉल इस रूप में सहेजें क्लिक करें . फ़ाइल सहेजने के लिए स्थान का चयन करें. फ़ाइल नाम डालें. विंडो बंद करने के लिए सहेजें पर क्लिक करें।
      2. टूलबार में फ़ाइल > बाहर निकलें क्लिक करें। इमेजर मैनुअल मोड में परिवर्तनों को सहेजने के लिए एक टैब खुलेगा। नहीं चुनें.
      3. प्रयोग 1 में परिवर्तनों को सहेजने के लिए एक टैब खुलेगा. नहीं चुनें. प्रोटोकॉल परिभाषा को अपडेट करने के लिए एक टैब खुलेगा। अपडेट करें चुनें. सॉफ़्टवेयर बंद करें।
  6. BioSpa OnDemand में प्रोटोकॉल आयात करें और प्रयोग स्थापित करना समाप्त करें।
    1. BioSpa OnDemand (शेड्यूलिंग सॉफ़्टवेयर) सॉफ़्टवेयर खोलें.
    2. सॉफ्टवेयर में उपलब्ध स्लॉट का चयन करें।
    3. लाइव सेल इमेजिंग सिस्टम से थाली निकालें. क्लिक करें दराज खोलें शेड्यूलिंग सॉफ़्टवेयर में उपयुक्त स्लॉट तक पहुँचने और प्लेट डालने के लिए। दराज बंद करें पर क्लिक करें.
      नोट: यह कदम किसी भी बिंदु पर किया जा सकता है एक बार प्रोटोकॉल ऊपर चरण 3.5.7 में बनाया गया है। हालांकि, प्लेट नीचे चरण 3.6.4.3 में एक समय चलाने के लिए साइटेशन 5 में होना चाहिए।
    4. प्रोटोकॉल आयात करें।
      1. प्रक्रिया की जानकारी टैब के अंतर्गत, ड्रॉप-डाउन मेनू में उपयोगकर्ता का चयन करें। प्रोटोकॉल स्लॉट के आगे, चुनें > एक नई प्रविष्टि जोड़ें पर क्लिक करें।
      2. प्रोटोकॉल स्लॉट के आगे, चुनें पर क्लिक करें. यह फ़ाइल आर्किटेक्चर में वांछित प्रोटोकॉल पर नेविगेट करने के लिए एक नई विंडो खोलेगा। प्रोटोकॉल को शेड्यूलिंग सॉफ़्टवेयर में आयात करने के लिए खोलें क्लिक करें.
      3. प्लेट की छवि के लिए आवश्यक समय की मात्रा दर्ज करें। Gen5 प्रोटोकॉल सूची विंडो को बंद करने के लिए ठीक क्लिक करें।
        नोट: यह कदम विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जब एक समय में कई प्रयोग चल रहे हैं। छवि बनाने के लिए आवश्यक समय निर्धारित करने के लिए, अभी समय चलाएँ निष्पादित करें पर क्लिक करें. ओके पर क्लिक करें।
    5. इमेजिंग अंतराल सेट करें और प्रयोग शेड्यूल करें।
      1. अंतराल के तहत, चरण 3.5.4 में निर्दिष्ट इमेजिंग अंतराल दर्ज करें।
      2. प्रारंभ समय विकल्प के अंतर्गत, उपलब्ध होने पर का चयन करें. अवधि के अंतर्गत, निश्चित या निरंतर का चयन करें.
        नोट: अगले उपलब्ध समय पर प्रोटोकॉल चलाने के बजाय एक विशिष्ट प्रारंभ समय निर्दिष्ट किया जा सकता है। निश्चित अवधि का चयन प्रयोग के लिए एक विशिष्ट समापन बिंदु सेट करेगा और उपयोगकर्ता को एक प्रयोगात्मक समय सीमा निर्दिष्ट करने की आवश्यकता होगी। निरंतर अवधि प्रयोग को बिना किसी समापन बिंदु के चलने देगी और इसे केवल उपयोगकर्ता द्वारा प्रयोग को रोकने से समाप्त किया जा सकता है।
      3. शेड्यूल प्लेट/पोत पर क्लिक करें। यह प्लेट सत्यापन अनुक्रम खोलेगा। प्रस्तावित पहले पढ़ने के समय के साथ एक टैब खुलेगा। इस शेड्यूल को स्वीकार करने के लिए हाँ क्लिक करें.

4. Gen5 सॉफ्टवेयर में छवि विश्लेषण (चित्र 2)

  1. छवि विश्लेषण मॉड्यूल खोलें।
    1. Gen5 खोलें। टास्क मैनेजर में, प्रयोग खोलें > चुनें. फ़ाइल खोलने के लिए प्रयोग का चयन करें. उपकरण पट्टी में > दृश्य प्लेट करें क्लिक करें.
    2. डेटा ड्रॉप-डाउन मेनू को Z प्रोजेक्शन में बदलें। रुचि के एक कुएं पर डबल-क्लिक करें। विश्लेषण करें > मैं एक नया छवि विश्लेषण डेटा कमी चरण सेटअप करना चाहता हूं का चयन करें। ओके पर क्लिक करें।
  2. सेलुलर विश्लेषण
    1. प्राथमिक मास्क
      1. विश्लेषण सेटिंग्स के अंतर्गत, प्रकार: सेलुलर विश्लेषण और खोज चैनल: ZProj[Tsf[उज्ज्वल क्षेत्र]] (बाएं पैनल, केंद्र) का चयन करें।
      2. विकल्प पर क्लिक करें. इससे प्राइमरी मास्क एंड काउंट पेज खुल जाएगा। थ्रेशोल्ड बॉक्स में, स्वचालित चेक करें और लागू करें क्लिक करें. निर्दिष्ट सीमा के भीतर ऑब्जेक्ट दिखाने के लिए ऑब्जेक्ट्स हाइलाइट करें बॉक्स (दायां पैनल, नीचे) पर क्लिक करें। रुचि की वस्तुओं को शामिल करने के लिए आवश्यकतानुसार समायोजित करें।
        नोट: थ्रेशोल्ड सेटिंग्स पिक्सेल तीव्रता पर आधारित हैं। उदाहरण के लिए, अगर थ्रेशोल्ड को 5000 पर सेट किया गया है, तो विश्लेषण में 5000 से अधिक तीव्रता वाले पिक्सेल शामिल किए जाएंगे.
      3. ऑब्जेक्ट चयन के तहत, न्यूनतम और अधिकतम ऑब्जेक्ट आकार (μm) निर्दिष्ट करें। सेलुलर मलबे / एकल कोशिकाओं को बाहर करने के लिए आवश्यक के रूप में समायोजित करें।
        नोट: पीडीओ आकार विभिन्न मॉडलों और प्रकारों के बीच काफी भिन्न हो सकता है। प्रत्येक मॉडल के लिए न्यूनतम और अधिकतम पीडीओ आकार थ्रेसहोल्ड निर्धारित करने के लिए Gen5 सॉफ्टवेयर में मापने के उपकरण का उपयोग करें। उपयोगकर्ता दवा उपचार के बाद बाद के समय बिंदुओं पर पीडीओ टुकड़ों के बहिष्करण को रोकने के लिए मापने के उपकरण द्वारा प्रदान किए गए मूल्य के सापेक्ष एक छोटा न्यूनतम पीडीओ आकार सीमा चुन सकते हैं।
      4. अच्छी तरह से के एक निश्चित क्षेत्र के लिए विश्लेषण सीमित करने के लिए, अचयनित संपूर्ण छवि का विश्लेषण करें और प्लग क्लिक करें. छवि प्लग विंडो में, प्लग आकार का चयन करने के लिए ड्रॉप-डाउन मेनू का उपयोग करें । ब्याज के क्षेत्र में फिट होने के लिए आवश्यक आकार और स्थिति मापदंडों को समायोजित करें।
        नोट: पृष्ठभूमि को कम करने के लिए पीडीओ मुक्त क्षेत्रों को छोड़कर प्लग के भीतर पीडीओ की संख्या को अधिकतम करना महत्वपूर्ण है। एक प्लग आकार निर्दिष्ट करें जो प्रतिकृतियों में ब्याज की अधिकांश वस्तुओं को लगातार कैप्चर करेगा। एक प्लग उत्पन्न करना जो गुंबद के किनारों को भी बाहर करता है, महत्वपूर्ण है क्योंकि यह किसी भी वस्तु को बाहर करता है जो किनारों के चारों ओर गुंबद के चरम वक्रता से प्रकाश के अपवर्तन के कारण विकृत दिखाई दे सकता है। प्राथमिक बढ़त वस्तुओं को भी प्लग के भीतर केवल पूरे पीडीओ पर कब्जा करने के लिए अचयनित किया जा सकता है.
    2. उप-जनसंख्या विश्लेषण। उप-जनसंख्या पदनाम का एक उदाहरण चित्र 3 में प्रदान किया गया है।
      1. सेलुलर विश्लेषण टूलबार में परिकलित मैट्रिक्स पर क्लिक करें। रुचि के ऑब्जेक्ट स्तर मीट्रिक चुनें या बनाएं (दायां कोना, नीचे) पर क्लिक करें। उपलब्ध ऑब्जेक्ट मीट्रिक के अंतर्गत, रुचि के मीट्रिक (उदा., परिपत्रता) का चयन करें और सम्मिलित करें बटन पर क्लिक करें. ओके पर क्लिक करें।
        नोट: प्रत्येक पीडीओ मॉडल की आकृति विज्ञान और घनत्व उप-जनसंख्या को अलग करने के लिए ब्याज की सर्वोत्तम मैट्रिक्स निर्धारित करेगा।
      2. Cellular Analysis टूलबार में SubPopulation Analysis पर क्लिक करें। नई उप-जनसंख्या बनाने के लिए जोड़ें पर क्लिक करें. एक पॉप-अप विंडो खुलेगी।
      3. यदि वांछित है, तो उप-जनसंख्या के लिए एक नाम दर्ज करें। ऑब्जेक्ट मेट्रिक्स के अंतर्गत, रुचि की मीट्रिक चुनें और शर्त जोड़ें दबाएँ. स्थिति संपादित करें विंडो में, चुने गए ऑब्जेक्ट मीट्रिक के लिए पैरामीटर दर्ज करें. आवश्यकतानुसार अतिरिक्त मीट्रिक के साथ दोहराएं।
        नोट: पैरामीटर मैन्युअल रूप से समायोजित किए जा सकते हैं या खोजक उपकरण का उपयोग करके सेट किए जा सकते हैं। उदाहरण के लिए, मलबे को बाहर करने के लिए, उपयोगकर्ता क्षेत्र को ऑब्जेक्ट मीट्रिक के रूप में जोड़ सकते हैं और 800 से छोटे ऑब्जेक्ट का चयन कर सकते हैं। ऑब्जेक्ट मीट्रिक के रूप में परिपत्रता नियमित रूप से उपयोग की जाती है, और मॉडल के आधार पर 0.2-0.5 से अधिक परिपत्र वाली किसी भी वस्तु को शामिल किया जाता है।
      4. विंडो के निचले भाग में तालिका में, प्रदर्शित करने के लिए वांछित परिणाम जांचें। लागू करने > ठीक क्लिक करें.
      5. उप-जनसंख्या के भीतर ऑब्जेक्ट देखने के लिए, उप-जनसंख्या का चयन करने के लिए ऑब्जेक्ट विवरण ड्रॉप-डाउन मेनू (दायां पैनल, केंद्र) का उपयोग करें। मापदंडों के भीतर आने वाली वस्तुओं को छवि में हाइलाइट किया जाएगा।
        नोट: प्राथमिक मास्क और उप-जनसंख्या के हाइलाइट रंगों को बदलने के लिए, सेटिंग्स (दाएं पैनल, नीचे) पर क्लिक करें।
      6. उप-जनसंख्या पैरामीटर समायोजित करने के लिए, सेलुलर विश्लेषण उपकरण पट्टी से उप-जनसंख्या विश्लेषण विंडो को फिर से खोलें। उप-जनसंख्या चुनें और संपादित करें पर क्लिक करें. चरण जोड़ें पर क्लिक करें.
        नोट: यह हर समय बिंदुओं पर प्रयोग के भीतर सभी कुओं के लिए एक ही विश्लेषण लागू होगा। मैट्रिक्स पृष्ठ पर ड्रॉप-डाउन मेनू में, अलग-अलग देखने के लिए विभिन्न मीट्रिक का चयन किया जा सकता है।

5. Gen5 से Excel में डेटा निर्यात करना

  1. निर्यात के लिए डेटा फ़ाइल को अनुकूलित करने के लिए, टूलबार में रिपोर्ट/निर्यात बिल्डर्स आइकन चुनें। पॉप-अप विंडो में, Excel में नया निर्यात करें पर क्लिक करें.
  2. पॉप-अप विंडो के गुण पृष्ठ पर, प्लेट > क्षेत्र और कस्टम > सामग्री का चयन करें। टूलबार में कंटेंट विकल्प पर क्लिक करें। टेम्पलेट संपादित करें पर क्लिक करें, जो एक्सेल प्रोग्राम खोलेगा।
  3. स्प्रेडशीट के भीतर, ऐड-इन्स > टेबल > वेल डेटा का चयन करें। निर्यात के विकल्प देखने के लिए विभिन्न चयनों पर होवर करें। रुचि का मीट्रिक चुनें (उदाहरण के लिए, ऑब्जेक्ट मीन[ZProj[Tsf[TRITC]]])।
    नोट:: प्लेट लेआउट स्प्रेडशीट विश्लेषण टेम्पलेट के लिए ऐड-इन्स > प्रोटोकॉल सारांश > लेआउट का चयन करके जोड़ा जा सकता है।
  4. एक एडिट विंडो खुलेगी। वेल्स बॉक्स में, वेल-आईडी या वेल # द्वारा निर्यात के लिए कुओं को नामित करें। ठीक का चयन करें. स्प्रेडशीट फ़ाइल में एक टेम्पलेट लोड किया जाएगा। स्प्रेडशीट बंद करें। टेम्पलेट स्वचालित रूप से सहेजा जाता है।
  5. Excel में नया निर्यात करें विंडो पर ठीक क्लिक करें और रिपोर्ट/बिल्डर्स निर्यात करें विंडो बंद करें.
  6. Gen5 टूलबार में निर्यात आइकन पर क्लिक करें। वांछित निर्यात फ़ाइल के बगल में स्थित बॉक्स को चेक करें। ओके पर क्लिक करें। Gen5 स्वचालित रूप से स्प्रेडशीट टेम्पलेट को पॉप्युलेट करेगा और फ़ाइल को Excel में खोलेगा।

6. बाहरी डेटा विश्लेषण

  1. Excel में निर्यात फ़ाइल (.xlsx) खोलें.
  2. प्रत्येक अच्छी तरह से के लिए, उस अच्छी तरह से के लिए 0:00 समय बिंदु मूल्य से प्रत्येक व्यक्तिगत मूल्य विभाजित. यह समय बिंदु 0 को 1 के बराबर सेट करेगा, और इससे आगे का प्रत्येक मान प्रारंभिक रीडिंग के सापेक्ष होगा।
  3. डेटा विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में एक नई फ़ाइल खोलें। XY लेआउट विकल्प चुनें।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में, ग्राफपैड प्रिज्म (संस्करण 9.5.1) का उपयोग किया गया था।
  4. प्रत्येक डेटा समूह के लिए इनपुट लेबल. कॉपी और प्रिज्म तालिका में प्रत्येक उपचार समूह के लिए समय अंक और इसी सामान्यीकृत मूल्यों को पेस्ट करें। डेटा के लिए एक ग्राफ स्वचालित रूप से उत्पन्न हो जाएगा और ग्राफ़ के तहत पाया जा सकता है।

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Representative Results

हमारा उद्देश्य पीडीओ चिकित्सीय प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए मल्टीप्लेक्स लाइव-सेल इमेजिंग का उपयोग करने की व्यवहार्यता का प्रदर्शन करना था। अवधारणा प्रयोगों का प्रमाण एंडोमेट्रियल कैंसर के दो अलग-अलग पीडीओ मॉडल में किया गया था: ओएनसी -10817 और ओएनसी -10811 (ओएनसी -10811 डेटा के लिए पूरक चित्रा 1 और पूरक चित्रा 2 देखें)। एपोप्टोसिस (एनेक्सिन वी धुंधला) और साइटोटॉक्सिसिटी (साइटोटॉक्स ग्रीन तेज) को एपोप्टोसिस-उत्प्रेरण एजेंट, स्टॉरोस्पोरिन के जवाब में गतिज रूप से निगरानी की गई थी। विशेष रूप से, पीडीओ को 96-अच्छी प्लेटों में चढ़ाया गया था, एनेक्सिन वी रेड और साइटोटॉक्स ग्रीन रंगों के साथ इलाज किया गया था, और चित्रा 1 में आरेखित के रूप में रातोंरात 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखा गया था। हमने दो स्वतंत्र पीडीओ मॉडल में पुष्टि की है कि एनेक्सिन वी और साइटोटॉक्स ग्रीन रंगों के साथ उपचार विषाक्त नहीं है (पूरक चित्रा 2)। अगले दिन, पीडीओ को स्टॉरोस्पोरिन (0.01 एनएम, 0.1 एनएम, 1 एनएम, 10 एनएम, 100 एनएम, 500 एनएम) की बढ़ती सांद्रता के साथ इलाज किया गया था। इसके बाद, Gen5 सॉफ्टवेयर में प्रोटोकॉल स्थापित किए गए थे और प्रयोगों को 5 दिनों की अवधि में चलाने के लिए सेट किया गया था, हर 6 घंटे में इमेजिंग। प्रोटोकॉल की धारा 4 में वर्णित Gen5 सॉफ़्टवेयर में सेलुलर विश्लेषण फ़ंक्शन का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण किया गया था। प्राथमिक मास्क "स्प्लिट छू वस्तुओं" अनियंत्रित और न्यूनतम के आकार मापदंडों के साथ ऑटो थ्रेशोल्ड समारोह का उपयोग कर सेट किया गया था: 30 माइक्रोन और अधिकतम: 1000 माइक्रोन. पीडीओ उप-जनसंख्या को 0.25 > परिपत्र द्वारा परिभाषित किया गया था। नामित पीडीओ उप-जनसंख्या के भीतर TRITC (एनेक्सिन वी, एपोप्टोसिस) और GFP चैनलों (साइटोटॉक्स ग्रीन, साइटोटॉक्सिसिटी) में ऑब्जेक्ट मीन इंटेंसिटी को आगे के विश्लेषण के लिए .xlsx फ़ाइल के रूप में निर्यात किया गया था। GFP और TRITC दोनों चैनलों में प्रत्येक समय बिंदु पर प्रत्येक अच्छी तरह से के लिए वस्तु मतलब तीव्रता समय 0 के लिए सामान्यीकृत किया गया था. सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति डेटा तो एक प्रिज्म फ़ाइल में स्थानांतरित कर दिया और एक लाइन साजिश के रूप में कल्पना की.

स्टॉरोस्पोरिन के साथ उपचार के परिणामस्वरूप एपोप्टोसिस में एक महत्वपूर्ण, खुराक पर निर्भर वृद्धि हुई और वाहन नियंत्रण की तुलना में समय के साथ सेल स्वास्थ्य में कमी आई, जैसा कि टीआरआईटीसी (एनेक्सिन वी) और जीएफपी (साइटोटॉक्स) चैनलों (चित्रा 4, चित्रा 5, पूरक वीडियो 1, पूरक वीडियो 2, पूरक वीडियो 3, अनुपूरक वीडियो 4, पूरक वीडियो 5, पूरक वीडियो 6, और पूरक वीडियो 7)। स्टॉरोस्पोरिन की 500 एनएम, 100 एनएम, और 10 एनएम खुराक प्रत्येक के परिणामस्वरूप समय के साथ एपोप्टोसिस और साइटोटॉक्सिसिटी दोनों में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण वृद्धि हुई(चित्रा 5ए-सी) के साथ-साथ प्रयोग के अंत में(चित्रा 5ई,एफ)। इसके अलावा, स्टॉरोस्पोरिन ने इन सांद्रता में पीडीओ विकास और गठन को प्रभावी ढंग से बाधित किया, जैसा कि कुल पीडीओ क्षेत्र में समग्र कमी से प्रदर्शित होता है, जबकि नियंत्रण कुओं ने कुल पीडीओ क्षेत्र(चित्रा 4 और चित्रा 5डी)में वृद्धि का प्रदर्शन किया।

चूंकि लाइव-सेल इमेजिंग का एक प्रमुख लाभ चढ़ाना में परिवर्तनशीलता के लिए सही करने की क्षमता है, इसलिए हमने एक प्रयोग किया जिससे सेल व्यवहार्यता का मूल्यांकन समापन बिंदु उपाय के रूप में किया गया था। प्रूफ-ऑफ-कॉन्सेप्ट एंडपॉइंट परख डेटा एक पीडीओ मॉडल का उपयोग करके एकत्र किया गया था जो प्रोस्टेट कैंसर के रोगी-व्युत्पन्न ज़ेनोग्राफ्ट से उत्पन्न हुआ था। उज्ज्वल क्षेत्र छवियों उपचार अवधि (0 दिन) की शुरुआत में एकत्र किए गए थे, एक दोहरी डाई अभिकर्मक है कि व्यवहार्यता (acridine नारंगी, एओ) और कोशिका मृत्यु (प्रोपिडियम आयोडाइड, पीआई) दोनों उपायों के अलावा के द्वारा पीछा किया. एओ घटक डबल फंसे डीएनए, सेल व्यवहार्यता का एक संकेतक करने के लिए बाध्यकारी पर एक हरे फ्लोरोसेंट संकेत का उत्सर्जन करता है। पीआई घटक मृत न्यूक्लियेटेड कोशिकाओं को दाग देता है और उपचार के जवाब में कोशिका मृत्यु को निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। पीडीओ चढ़ाना में परिवर्तनशीलता के लिए खाते में, हम डिजिटल चरण विपरीत छवियों (अनुपूरक चित्रा 3 और पूरक फ़ाइल 1) के लिए उज्ज्वल क्षेत्र छवियों को परिवर्तित करके समय 0 पर अच्छी तरह से प्रति पीडीओ की संख्या निर्धारित करने के लिए एक विधि तैयार की.

प्रोस्टेट कैंसर पीडीओ को 7 दिनों के लिए ड्यूनोरूबिसिन, एक कीमोथेरेपी एजेंट जो कोशिका मृत्यु का कारण बनता है, के साथ इलाज किया गया था। प्रयोग के पूरा होने पर, नमूने पूरक फ़ाइल 1 में वर्णित के रूप में AOPI के साथ दाग रहे थे, Gen5 में फ्लोरोसेंट छवियों के विश्लेषण के बाद. चित्रा 6 ए दिन 7 पर एओपीआई समापन बिंदु परख से छवियों का एक पैनल दिखाता है। जब 10 माइक्रोन daunorubicin (पंक्ति दो) के साथ इलाज पीडीओ के लिए वाहन इलाज पीडीओ (पंक्ति एक) की तुलना, हरी प्रतिदीप्ति (व्यवहार्यता के उपाय, स्तंभ दो) और लाल प्रतिदीप्ति (कोशिका मृत्यु के उपाय, स्तंभ तीन) में एक स्पष्ट कमी थी. इन परिणामों को तब चित्रा 6 बी में मात्रा निर्धारित की गई थी, जहां हम एओपीआई समापन बिंदु धुंधला तकनीक का उपयोग करके प्राप्त किए जा सकने वाले रीडआउट की सरणी दिखाते हैं। ऊपरी बाएँ भूखंड एओ दाग से उत्पन्न व्यवहार्यता माप को दर्शाता है, जो दिन 0 पर प्रत्येक कुएं के डिजिटल चरण कंट्रास्ट छवि विश्लेषण द्वारा निर्धारित पीडीओ गिनती के लिए सामान्यीकृत है। ये डेटा चित्रा 6 ए से दृश्य परिणाम के साथ सहसंबंधित हैं, जिससे ड्यूनोरूबिसिन की एकाग्रता में वृद्धि हुई, व्यवहार्यता में काफी कमी आई। यह आगे ऊपरी दाएं ग्राफ में पुनरावृत्ति की जाती है, जो पीआई दाग के साथ अधिग्रहित लाल प्रतिदीप्ति में वृद्धि से निरूपित कोशिका मृत्यु में वृद्धि को दर्शाता है।

पीआई डेटा को तब व्यवहार्यता पढ़ने (एओ) के साथ जोड़ा गया था ताकि मृत अनुपात (चित्रा 6बी, निचले बाएं ग्राफ) के लिए व्यवहार्य गणना की जा सके। यह अनुपात यह निर्धारित करने के लिए एक उपयोगी दृष्टिकोण है कि कोई दवा साइटोस्टैटिक या साइटोटॉक्सिक है या नहीं। विशेष रूप से, एक साइटोटोक्सिक दवा इस तथ्य के कारण साइटोस्टैटिक दवा की तुलना में 0 के बहुत करीब पहुंच जाएगी कि साइटोस्टैटिक एक दवा विकास को रोक देगी लेकिन कोशिका मृत्यु को प्रेरित नहीं कर सकती है। अंत में, पीडीओ के क्षेत्र सही एओ दाग के हरे रंग प्रतिदीप्ति का उपयोग कर गणना की जा सकती है, यहां तक कि जब पीडीओ कोशिका मृत्यु और blebbing दौर से गुजर रहा हो सकता है. निचला दायां ग्राफ औसत पीडीओ क्षेत्र को दर्शाता है, जिसकी गणना पीडीओ संख्या द्वारा विभाजित उप-जनसंख्या विश्लेषण में दर्शाए गए क्षेत्र के योग के रूप में की गई थी। क्षेत्र का विश्लेषण आगे संकेत दे सकता है कि क्या कोई उपचार केवल पीडीओ विकास को रोक रहा है या वास्तव में पीडीओ प्रतिगमन का कारण बन रहा है। ध्यान दें कि औसत पीडीओ क्षेत्र का विश्लेषण जीएफपी चैनल और सेलुलर विश्लेषण फ़ंक्शन का उपयोग करके किया गया था, चित्रा 5 डी के विपरीत, जो कुल पीडीओ क्षेत्र की गणना करने के लिए उज्ज्वल क्षेत्र छवियों का उपयोग करता था। ये डेटा डेटा उपलब्धता और उपयोगकर्ता हित के आधार पर विश्लेषण पाइपलाइन के लचीलेपन को उजागर करते हैं।

अंत में, हमने व्यवहार्यता रीडिंग, सेलटिटर-ग्लो 3 डी के लिए सोने के मानक की तुलना एओपीआई(चित्रा 6सी)का उपयोग करके व्यवहार्यता प्रतिदीप्ति पढ़ने से की। ध्यान दें कि इस पैनल में डेटा समय 0 पीडीओ संख्या के लिए सामान्यीकृत नहीं किया गया था क्योंकि यह सामान्यीकरण आमतौर पर सेलटिटर-ग्लो 3 डी किट का उपयोग करने वाली प्रयोगशालाओं द्वारा नहीं किया जाता है। हमने दोनों परखों में दवा प्रभाव के लिए एक ही प्रवृत्ति देखी, जिससे पीडीओ व्यवहार्यता में कमी आई क्योंकि ड्यूनोरूबिसिन एकाग्रता में वृद्धि हुई। इन रीडआउट्स के बीच एकमात्र दृश्य अंतर यह था कि सेलटिटर-ग्लो 3 डी विश्लेषण एओपीआई विश्लेषण से पहले आईसी 50 तक पहुंच गया और लगभग पूरी तरह से 0 तक पहुंच गया। इस परिणाम को ड्यूनोरूबिसिन की कार्रवाई के तंत्र द्वारा समझाया जा सकता है। Daunorubicin एक टोपोइसोमेरेज़-II अवरोधक है जो डबल-फंसे डीएनए ब्रेक का परिचय देता है, जिससे सेल चक्र गिरफ्तारी और अंततः एपोप्टोसिस14 हो जाता है। सेल चक्र गिरफ्तारी के दौरान, एटीपी की कमी15 हो सकती है। यह देखते हुए कि सेलटिटर-ग्लो 3 डी परख एक ल्यूमिनेसेंस सिग्नल उत्पन्न करने के लिए एटीपी-लूसिफ़ेरेज़ प्रतिक्रिया पर आधारित है, हम परिकल्पना करते हैं कि ड्यूनोरूबिसिन की उच्च सांद्रता में सेल व्यवहार्यता में मजबूत कमी पूर्ण कोशिका मृत्यु के बजाय एटीपी की कमी के कारण थी। इस विचार का समर्थन करते हुए, चित्रा 6 ए में छवियों संस्कृति में पीडीओ रहने वाले आबादी को दर्शाया गया है, जैसा कि हरे प्रतिदीप्ति द्वारा दर्शाया गया है।

Figure 1
चित्रा 1: चढ़ाना, इमेजिंग, और विश्लेषण प्रोटोकॉल का अवलोकन. पीडीओ एक 96 अच्छी तरह से थाली में चढ़ाया जाता है और फ्लोरोसेंट रंजक और दवाओं के साथ इलाज कर रहे हैं. प्रयोग के लिए इमेजिंग पैरामीटर (जैसे, एक्सपोजर, जेड-स्टैक) Gen5 सॉफ्टवेयर में बनाए गए हैं। छवियों को Cytation 5 द्वारा अधिग्रहित किया जाता है और Gen5 में संसाधित किया जाता है, और डेटा को आगे के विश्लेषण के लिए निर्यात किया जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: सेलुलर विश्लेषण सुविधा का अवलोकन। 1: प्लग नामित करें: रुचि के क्षेत्रों को शामिल करने के लिए एक प्लग नामित किया गया है। 2: प्राथमिक मास्क सेट करें: प्राथमिक मास्क पसंद के चैनल में आकार और पिक्सेल तीव्रता के आधार पर ब्याज की वस्तुओं को परिभाषित करता है। इस प्रतिनिधि छवि में, प्राथमिक मुखौटा में शामिल वस्तुओं को बैंगनी रंग में रेखांकित किया गया है। 3: उप-जनसंख्या को परिभाषित करें: विश्लेषण के लिए वांछित जनसंख्या को और परिष्कृत करने के लिए एक अतिरिक्त उप-जनसंख्या को परिभाषित किया जा सकता है। उदाहरण छवि (पीले रंग में उल्लिखित) में उप-जनसंख्या को परिपत्र (>0.25) और क्षेत्र (>800) के आधार पर परिभाषित किया गया है। छवियों को 4x उद्देश्य के साथ अधिग्रहित किया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: सेलुलर विश्लेषण सुविधा का उपयोग कर उप-जनसंख्या मास्किंग के उदाहरण। उप-जनसंख्या को उज्ज्वल क्षेत्र चैनल में परिभाषित किया गया है। उदाहरण छवियों (पीले रंग में उल्लिखित) में उप-जनसंख्या को परिपत्र (>0.25) और क्षेत्र (>800) के आधार पर परिभाषित किया गया है। छवियों को 4X उद्देश्य के साथ अधिग्रहित किया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: स्टॉरोस्पोरिन उपचार के परिणामस्वरूप एपोप्टोसिस और साइटोटॉक्सिसिटी में खुराक पर निर्भर वृद्धि होती है। GFP और TRITC प्रतिदीप्ति ओवरले के साथ उज्ज्वल क्षेत्र छवियों (4x उद्देश्य) 500 एनएम, 10 एनएम, और 3 समय बिंदुओं पर staurosporine के 0.1 एनएम खुराक के लिए दिखाया जाता है: 0 घंटे, 54 घंटे, 114 घंटे. लाल फ्लोरोसेंट संकेत एपोप्टोसिस (एनेक्सिन वी) को इंगित करता है, और हरा फ्लोरोसेंट संकेत साइटोटॉक्सिसिटी (साइटोटॉक्स) को इंगित करता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: पीडीओ प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए मल्टीप्लेक्स फ्लोरोसेंट लाइव-सेल इमेजिंग। पीडीओ मॉडल ओएनसी -10817 को 96-अच्छी प्लेटों में चढ़ाया गया था और एनेक्सिन वी रेड (1:400), और साइटोटॉक्स ग्रीन (200 एनएम) रंगों के साथ रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया गया था। अगले दिन, पीडीओ staurosporine की बढ़ती सांद्रता के साथ इलाज किया गया और ~ 5 दिनों के लिए हर 6 घंटे imaged थे. (ए, बी) स्टॉरोस्पोरिन के जवाब में (ए) साइटोटॉक्सिसिटी या (बी) एपोप्टोसिस में समय और खुराक पर निर्भर वृद्धि। डेटा को GFP या TRITC चैनल में ऑब्जेक्ट मीन इंटेंसिटी के रूप में प्लॉट किया गया था। (सी) 100 एनएम या 500 एनएम स्टॉरोस्पोरिन के जवाब में एपोप्टोसिस और साइटोटॉक्सिसिटी के समय पाठ्यक्रम की तुलना। डेटा को GFP और TRITC चैनलों में ऑब्जेक्ट मीन इंटेंसिटी वैल्यू के रूप में प्लॉट किया गया था। (D) स्टॉरोस्पोरिन पीडीओ की वृद्धि को रोकता है। डेटा को औसत कुल पीडीओ क्षेत्र के रूप में प्लॉट किया गया था। ए-डी में डेटा को प्रत्येक कुएं में 0 घंटे के समय पीडीओ संख्या के लिए सामान्यीकृत किया गया था और माध्य (एसईएम) के माध्य और मानक त्रुटि के रूप में प्लॉट किया गया था। एन = 5 तकनीकी प्रति उपचार प्रतिकृतियां। पी < 0.0001 बनाम 2-तरफा एनोवा द्वारा वाहन नियंत्रण। (ई) प्रतिनिधि उज्ज्वल क्षेत्र, जीएफपी, और प्रयोग के अंत में 500 एनएम स्टॉरोस्पोरिन-उपचारित पीडीओ बनाम वाहन की टीआरआईटीसी छवियां (114 एच)। छवियों को 4x उद्देश्य के साथ अधिग्रहित किया गया था। (एफ) 114 घंटे समय बिंदु पर साइटोटॉक्सिसिटी, एपोप्टोसिस और व्यवहार्यता की मात्रा का ठहराव। GFP ऑब्जेक्ट मीन इंटेंसिटी (बाएं) और TRITC ऑब्जेक्ट मीन इंटेंसिटी (मध्य) की गणना पैनल एसी के परिणामों का उपयोग करके 114 घंटे टाइमपॉइंट पर की गई थी। व्यवहार्यता (दाएं) निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार CellTiter-Glo 3 डी अभिकर्मक का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया था. कच्चे ल्यूमिनेसेंस (आरएलयू) मूल्यों को 0 घंटे के समय कुल पीडीओ क्षेत्र में सामान्यीकृत किया गया था और वाहन नियंत्रण के सापेक्ष गुना व्यवहार्यता के रूप में प्लॉट किया गया था, जिसे 1.0 पर सेट किया गया था। ** पी<0.01, ***पी<0.001, **** पी<0.0001 बनाम वाहन नियंत्रण डनेट के पोस्ट-हॉक परीक्षण के साथ एक-तरफ़ा एनोवा के माध्यम से। एन = 5 तकनीकी प्रति उपचार प्रतिकृतियां। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: समापन बिंदु परख डेटा के सामान्यीकरण में सहायता के लिए लाइव सेल इमेजिंग का उपयोग। पीडीओ को 7 दिनों के लिए टोपोइसोमेरेज़-द्वितीय अवरोधक, डूनोरूबिसिन की बढ़ती सांद्रता के साथ इलाज किया गया था। पीडीओ को एओपीआई धुंधला समाधान से अवगत कराया गया था और पूरक फ़ाइल 1 में वर्णित के रूप में चित्रित किया गया था। एओ = एक्रिडाइन नारंगी, व्यवहार्यता का एक उपाय (जीएफपी चैनल); पीआई = प्रोपिडियम आयोडाइड, कोशिका मृत्यु का एक उपाय (टेक्सास रेड चैनल)। (ए)10 माइक्रोन डूनोरूबिसिन या वाहन नियंत्रण (0.1% डीएमएसओ) के साथ उपचार के 7 दिनों के बाद एओपीआई धुंधला का उपयोग करके प्राप्त प्रतिनिधि छवियां। (बी)समापन बिंदु व्यवहार्यता/कोशिका मृत्यु विधि के रूप में एओपीआई प्रतिदीप्ति का उपयोग करके विभिन्न रीडआउट। विश्लेषण विधियों के विस्तृत विवरण के लिए पूरक फ़ाइल 1 देखें। ऊपरी बाएं, एओ धुंधला द्वारा निर्धारित 7 दिनों के बाद पीडीओ व्यवहार्यता का विश्लेषण। ऊपरी दाएं, पीआई धुंधला द्वारा कोशिका मृत्यु का विश्लेषण। एओ और पीआई धुंधला के लिए डेटा समय 0 घंटे पर पीडीओ संख्या के लिए सामान्यीकृत किया गया था और फिर वाहन नियंत्रण, जो 1.0 पर सेट किया गया था, और मतलब और मानक विचलन के रूप में साजिश रची गई। निचले बाएं, एओ और पीआई दाग के लिए औसत वस्तु अभिन्न का उपयोग करके मृत अनुपात के लिए व्यवहार्य की गणना। निचले दाएं, पीडीओ का क्षेत्र जैसा कि एओ धुंधला द्वारा निर्धारित किया गया है। सेलुलर विश्लेषण GFP चैनल में किया गया था. (सी) पीडीओ व्यवहार्यता का परीक्षण करने के लिए दो तरीकों की तुलना। इमेजिंग के बाद, निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार सेलटिटर-ग्लो 3 डी अभिकर्मक का उपयोग करके व्यवहार्यता का मूल्यांकन किया गया था। वाहन नियंत्रण के सापेक्ष गुना अस्तित्व को डूनोरूबिसिन की बढ़ती सांद्रता पर प्लॉट किया गया था। डेटा एन = 6 तकनीकी प्रतिकृतियों प्रति उपचार के लिए माध्य और मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करता है; डेटा पैनल सी में समय 0 घंटे के लिए सामान्यीकृत नहीं थे. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

उपचार # कुओं का मीडिया वॉल्यूम एनेक्सिन 100 माइक्रोन साइटोटॉक्स
तनूकरण आयतन तनूकरण आयतन
मल्टीपलेक्स 60 6.6 एमएल 1:400 16.5 माइक्रोन 200 एनएम 13.2 माइक्रोन

तालिका 1: उदाहरण बहुसंकेतन प्रयोग। एनेक्सिन वी रेड एपोप्टोटिक कोशिका झिल्ली के बाहरी पत्रक पर फॉस्फेटिडिल सेरीन को उजागर करता है। साइटोटॉक्स ग्रीन समझौता झिल्ली अखंडता के साथ कोशिकाओं में एकीकृत होता है और डीएनए को बांधता है।

अनुपूरक चित्रा 1: ओएनसी -10811 की मल्टीप्लेक्स लाइव-सेल इमेजिंग। पीडीओ को 96-अच्छी प्लेटों में चढ़ाया गया था और एनेक्सिन वी रेड (1:400), और साइटोटॉक्स ग्रीन (200 एनएम) रंगों में रातोंरात 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया गया था। अगले दिन, पीडीओ staurosporine की बढ़ती सांद्रता के साथ इलाज किया गया और 5 दिनों के लिए हर 6 घंटे imaged थे. (ए) स्टॉरोस्पोरिन के जवाब में साइटोटॉक्सिसिटी में समय और खुराक पर निर्भर वृद्धि। डेटा GFP चैनल में वस्तु मतलब तीव्रता के रूप में साजिश रची गई. (बी) 114 घंटे में स्टॉरोस्पोरिन की खुराक-प्रतिक्रिया। डेटा 114 घंटे समय बिंदु पर GFP चैनल में वस्तु मतलब तीव्रता मूल्यों के रूप में साजिश रची गई. (सी) स्टॉरोस्पोरिन के जवाब में एपोप्टोसिस में समय और खुराक पर निर्भर वृद्धि। डेटा को TRITC चैनल में ऑब्जेक्ट मीन इंटेंसिटी के रूप में प्लॉट किया गया था। (डी) 114 घंटे में स्टॉरोस्पोरिन की खुराक-प्रतिक्रिया। डेटा को 114 घंटे टाइमपॉइंट पर TRITC चैनल में ऑब्जेक्ट मीन इंटेंसिटी मानों के रूप में प्लॉट किया गया था। ए और सी में डेटा को अच्छी तरह से स्तर पर 0 घंटे के समय पीडीओ संख्या के लिए सामान्यीकृत किया गया था। एन = प्रत्येक मॉडल में प्रति उपचार 5 तकनीकी प्रतिकृतियां। पी < 0.0001 बनाम 2-तरफा एनोवा द्वारा वाहन नियंत्रण। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 2: एनेक्सिन वी और साइटोटॉक्स के साथ उपचार पीडीओ व्यवहार्यता को परेशान नहीं करता है। पीडीओ को 96-अच्छी प्लेटों में चढ़ाया गया था और एनेक्सिन वी रेड (1:400) और साइटोटॉक्स ग्रीन (200 एनएम) रंगों के साथ रातोंरात 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया गया था। 24 घंटे इनक्यूबेशन के बाद, निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार सेलटिटर-ग्लो 3 डी परख का उपयोग करके व्यवहार्यता का मूल्यांकन किया गया था। (ए) 24 घंटे समय बिंदु पर डाई-उपचारित और अनुपचारित पीडीओ में व्यवहार्यता। पीडीओ योग क्षेत्र के लिए सामान्यीकृत सापेक्ष प्रकाश इकाई (आरएलयू) मान और मूल्य दोनों प्रस्तुत किए जाते हैं। विशेष रूप से, प्रत्येक अच्छी तरह से के लिए CellTiter-Glo3D RLU चढ़ाना के समय (यानी, तुरंत डाई जोड़ के बाद) कि अच्छी तरह से के लिए पीडीओ क्षेत्र के योग के लिए सामान्यीकृत किया गया था. कुल पीडीओ क्षेत्र सेलुलर विश्लेषण में "ऑब्जेक्ट योग क्षेत्र" गणना का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। एन = 10. (बी) 114 घंटे टाइमपॉइंट पर डाई-उपचारित और अनुपचारित पीडीओ में व्यवहार्यता। कच्चे ल्यूमिनेसेंस मान और कुल पीडीओ क्षेत्र के लिए सामान्यीकृत मूल्य दोनों प्रस्तुत किए जाते हैं। प्रत्येक अच्छी तरह से के लिए CellTiter-Glo3D RLU गतिज इमेजिंग प्रयोगों में समय 0 घंटे से मेल खाती है जो 24 घंटे के बाद चढ़ाना पर पीडीओ क्षेत्र के योग के लिए सामान्यीकृत किया गया था. एन = 5. ए और बी में महत्व का मूल्यांकन एक अप्रकाशित टी-परीक्षण का उपयोग करके किया गया था; पी मान रेखांकन पर सूचीबद्ध हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 3: डिजिटल चरण विपरीत का उपयोग कर पीडीओ के लेबल मुक्त विश्लेषण. इस आंकड़े में प्रतिनिधि छवियां (2.5x उद्देश्य) शामिल हैं जो पूरक फ़ाइल 1 में वर्णित लेबल-मुक्त विश्लेषण को दर्शाती हैं: जेन 5 सॉफ्टवेयर में दृश्य विश्लेषण (ब्राइट फील्ड / डिजिटल चरण कंट्रास्ट छवियां) और डिजिटल चरण कंट्रास्ट छवि विश्लेषण के एकल फोकल प्लेन के लिए इमेजिंग पैरामीटर सेट करना। (ए) उदाहरण एक एकल फोकल विमान पर प्रोस्टेट कैंसर पीडीएक्सओ मॉडल की उज्ज्वल क्षेत्र छवि। (बी) ए में उज्ज्वल क्षेत्र छवि को डिजिटल चरण कंट्रास्ट छवि में बदल दिया गया था। उज्ज्वल क्षेत्र छवि में अंधेरे ऑब्जेक्ट डिजिटल चरण कंट्रास्ट छवि में उज्ज्वल दिखाई देते हैं और इसके विपरीत। (सी) डिजिटल चरण विपरीत छवि का उपयोग कर पीडीओ मास्किंग का उदाहरण। ध्यान दें कि ब्याज की वस्तुओं के किनारों को उज्ज्वल क्षेत्र छवियों की तुलना में बहुत अधिक परिभाषित किया जाता है। इस प्रतिनिधि छवि में, प्राथमिक मुखौटा में वस्तुओं को पीले रंग में रेखांकित किया गया है। (सी) (गुलाबी रंग में उल्लिखित) में उप-जनसंख्या को परिपत्र (>0.3), क्षेत्र (>1000), मीन [Dig.Ph.Con] > 2000, StdDev[Dig.Ph.con] > 5000 + < 13500, और पीक [Dig.Ph.Con] > 12500 के आधार पर परिभाषित किया गया है। इस प्रतिनिधि आंकड़े में उपयोग किए गए मापदंडों को दिन 0 पर सेल गिनती को सामान्य करने के लिए चित्रा 6 में डेटा पर लागू किया गया था। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 4: पीडीओ मॉडल उनके आकृति विज्ञान और चढ़ाना स्थिरता में भिन्न हो सकते हैं। ऊपरी पैनल: बीएमई गुंबदों में पीडीओ के अंतर फैलाव के उदाहरण। निचला पैनल: डिस्कोहेसिव बनाम परिपत्र पीडीओ की प्रतिनिधि छवियां। सभी छवियों को एक EVOS माइक्रोस्कोप के साथ अधिग्रहण किया गया. आवर्धन नोट किए जाते हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 5: प्रतिदीप्ति की मात्रा निर्धारित करने के लिए सेलुलर विश्लेषण बनाम छवि सांख्यिकी का उपयोग कर उदाहरण छवियों. सेलुलर विश्लेषण का उपयोग करके, उपयोगकर्ता एक छवि के भीतर विशिष्ट आबादी को परिभाषित कर सकते हैं और उन क्षेत्रों में प्रतिदीप्ति को माप सकते हैं। छवि सांख्यिकी का उपयोग पृष्ठभूमि संकेतों को बाहर करने के लिए एक सीमा को परिभाषित करके एक छवि में प्रतिदीप्ति को मापने के लिए भी किया जा सकता है। छवि आंकड़ों का उपयोग करने की सीमाओं के लिए चर्चा देखें। इमेज 4x आवर्धन पर हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक तालिका 1: ऑर्गेनॉइड कल्चर मीडिया घटक। ध्यान दें कि अभिकर्मकों स्त्री रोग संबंधी कैंसर पीडीओ संवर्धन के लिए अनुकूलित किया गया है. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक वीडियो 1: छवियों के साथ 500 एनएम staurosporine उपचार के समय चूक वीडियो हर 6 घंटे का अधिग्रहण किया. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक वीडियो 2: छवियों हर 6 घंटे हासिल की साथ 100 एनएम staurosporine उपचार के समय चूक वीडियो. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक वीडियो 3: छवियों के साथ 10 एनएम staurosporine उपचार के समय चूक वीडियो हर 6 घंटे का अधिग्रहण किया. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक वीडियो 4: छवियों के साथ 1 एनएम staurosporine उपचार के समय चूक वीडियो हर 6 घंटे का अधिग्रहण किया. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक वीडियो 5: छवियों के साथ 0.1 एनएम staurosporine उपचार के समय चूक वीडियो हर 6 घंटे का अधिग्रहण किया. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक वीडियो 6: छवियों के साथ 0.01 एनएम staurosporine उपचार के समय चूक वीडियो हर 6 घंटे का अधिग्रहण किया. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक वीडियो 7: हर 6 घंटे में हासिल की गई छवियों के साथ वाहन (0.06% डीएमएसओ) का समय चूक वीडियो। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक फ़ाइल 1: पूरक प्रोटोकॉल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

पीडीओ संस्कृतियों सेलुलर प्रतिक्रियाओं और व्यवहार 2 को प्रतिबिंबित करने की उनकी क्षमता के कारण इन विट्रो मॉडल प्रणाली में तेजी से लोकप्रिय होते जा रहेहैं। पीडीओ पीढ़ी, संस्कृति और विस्तार तकनीकों में महत्वपूर्ण प्रगति हुई है, फिर भी चिकित्सीय प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण करने के तरीके पिछड़ गए हैं। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 3 डी व्यवहार्यता किट लिटिक समापन बिंदु परख हैं, संभावित मूल्यवान गतिज प्रतिक्रिया डेटा पर गायब हैं और अन्य तरीकों से बाद के विश्लेषणों को सीमित करतेहैं 8. उभरते अध्ययन पीडीओ मॉडल में दवा प्रतिक्रियाओं का आकलन करने के लिए लाइव-सेल इमेजिंग लागू कर रहे हैं। यहां, हम मल्टीप्लेक्स फ्लोरोसेंट लाइव-सेल इमेजिंग का उपयोग करके समय के साथ पीडीओ चिकित्सीय प्रतिक्रियाओं का आकलन करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं। मल्टीप्लेक्सिंग फ्लोरोसेंट रंजक विभिन्न सेलुलर प्रतिक्रियाओं को एक साथ मात्रा निर्धारित करने की अनुमति देता है। एपोप्टोसिस और साइटोटॉक्सिसिटी के अलावा, हम कल्पना करते हैं कि पीडीओ में अन्य फेनोटाइपिक प्रभावों की जांच करने के लिए भविष्य के अध्ययनों में इस दृष्टिकोण का विस्तार किया जा सकता है।

इस के साथ साथ प्रस्तुत प्रोटोकॉल गतिज उज्ज्वल क्षेत्र और पीडीओ के फ्लोरोसेंट छवियों एक 96 अच्छी तरह से थाली में गुंबद के रूप में चढ़ाया प्राप्त करने के लिए बनाया गया है. मुख्य चरणों में 1) चढ़ाना, 2) डाई और दवा के साथ इलाज करना, 3) इमेजिंग मापदंडों को परिभाषित करना, 4) काइनेटिक छवि अधिग्रहण के पूरा होने पर छवि प्रीप्रोसेसिंग और विश्लेषण, और 5) अन्य सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर(चित्रा 1)में विश्लेषण के लिए डेटा निर्यात शामिल हैं। बरकरार पीडीओ को 96-अच्छी प्लेट में 5 माइक्रोन बीएमई गुंबदों के रूप में बीएमई और ऑर्गेनॉइड कल्चर मीडिया (आमतौर पर 1: 1) के पूर्वनिर्धारित अनुपात से बना किया जाता है। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल न्यूनतम बैच-टू-बैच परिवर्तनशीलता और इमेजिंग के लिए बेहतर ऑप्टिकल गुणों के कारण बीएमई के रूप में अल्टीमैट्रिक्स का उपयोग करता है। अन्य बीएमई में सुसंस्कृत पीडीओ की कटाई के लिए संशोधन, जैसे कि मैट्रिगेल, आवश्यक हो सकते हैं, साथ ही उन मॉडलों के लिए भी जो चिपचिपे और अलग करना मुश्किल है (उदाहरण अनुपूरक चित्र 4देखें)। इसके बाद, फ्लोरोसेंट रंगों को 100 माइक्रोन मात्रा में 2x एकाग्रता पर चढ़ाना (दिन -1) के समय ऑर्गेनॉइड कल्चर मीडिया में जोड़ा जाता है और बेसलाइन सेल मौत का निर्धारण करने के लिए रातोंरात इनक्यूबेट किया जाता है। अगले दिन (दिन 0), दवाओं या अन्य उपचार एक 100 माइक्रोन मात्रा में एक 2x एकाग्रता पर Organoid संस्कृति मीडिया के लिए जोड़ा जाता है, और फिर 200 μL की एक अंतिम मात्रा के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से जोड़ा. 200 माइक्रोन की अंतिम मात्रा इमेजिंग के साथ मेनिस्कस प्रभाव को कम करती है। काइनेटिक छवियों को बायोस्पा टेबलटॉप इनक्यूबेटर के साथ भागीदारी वाले साइटेशन 5 प्लेट रीडर का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है। बायोस्पा इनक्यूबेटर 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर्यावरण के निश्चित तापमान पर प्रयोगात्मक प्लेटों के इनक्यूबेशन की अनुमति देता है। बायोस्पा में 8 प्लेटों तक संग्रहीत किया जा सकता है और इस प्रकार, 8 प्रयोग एक साथ आयोजित किए जा सकते हैं। प्रत्येक प्लेट के लिए इमेजिंग पैरामीटर "इमेजर मैनुअल मोड" का उपयोग करके Gen5 सॉफ़्टवेयर में स्थापित किए गए हैं और प्रोटोकॉल के रूप में सहेजे गए हैं। प्रोटोकॉल को तब शेड्यूलिंग सॉफ़्टवेयर (BioSpa OnDemand) में लोड किया जाता है। BioSpa OnDemand सॉफ़्टवेयर गतिज छवि अधिग्रहण के लिए वर्कफ़्लो को स्वचालित करता है, जिसमें BioSpa इनक्यूबेटर से Cytation 5 में प्लेट का भौतिक हस्तांतरण और डेटा संग्रह के लिए Gen5 में कौन सा प्रोटोकॉल चलाना है, यह निर्धारित करना शामिल है। Gen5 सॉफ्टवेयर (चित्रा 2) में सेलुलर विश्लेषण समारोह का उपयोग कर छवियों का विश्लेषण कर रहे हैं. हम फ्लोरोसेंट और उज्ज्वल क्षेत्र छवियों के जेड अनुमानों का विश्लेषण करने के लिए विशिष्ट तरीकों का वर्णन करते हैं। एकल जेड विमानों और/या केवल उज्ज्वल क्षेत्र छवियों का विश्लेषण करने के लिए विशिष्ट तरीके पूरक फ़ाइल 1 में प्रदान किए जाते हैं। अंत में, उपयोगकर्ता दवा प्रभावों के बाद के सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए एक्सेल स्प्रेडशीट के रूप में निर्यात करने के लिए पीडीओ क्षेत्र, संख्या और औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता जैसे विशिष्ट डेटा सुविधाओं को परिभाषित कर सकते हैं।

यह देखते हुए कि पीडीओ मॉडल दवा प्रभावों से पूछताछ करने के लिए एक अपेक्षाकृत नई मॉडल प्रणाली है, संस्कृति की स्थिति को समायोजित करने के तरीके, विशेष रूप से बीएमई में वृद्धि, अभी भी16 उभर रहे हैं। दवा उपचार के लिए पीडीओ प्रतिक्रिया का आकलन करने वाले अधिकांश अध्ययन एटीपी-आधारित समापन बिंदु परख पर सेल स्वास्थ्य (सेलटिटर-ग्लो 3 डी) के लिए सरोगेट के रूप में भरोसा करते हैं। इस विधि सेल lysis की आवश्यकता है, इस प्रकार बाद बहाव विश्लेषण को छोड़कर. फ्लोरोसेंट धुंधला हो जाना, एकल timepoint इमेजिंग, और morphologic ट्रैकिंग के रूप में वैकल्पिक समापन बिंदु परख, अतिरिक्त प्रयोजनों के लिए नमूना उपयोग के लिए अनुमति देते हुए दवा प्रतिक्रिया को चिह्नित करने के लिए अन्य मीट्रिक प्रदान की है. उदाहरण के लिए, इन-प्लेट समापन बिंदु निर्धारण प्रोटोकॉल दवा प्रभाव17,18 के उच्च throughput विश्लेषण के लिए लागू किया गया है. इस विधि का एक फायदा यह है कि यह ठेठ immunohistochemistry और immunofluorescent इमेजिंग19 में आवश्यक व्यापक प्रसंस्करण circumvents और नमूना सीमित है, के रूप में पीडीओ मॉडल के लिए मामला है जब विशेष रूप से उपयोगी है. यह कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के लिए भी उत्तरदायी है। एक और समापन बिंदु परख है कि सेल lysis की आवश्यकता नहीं है ऐसे प्रोपिडियम आयोडाइड या acridine नारंगी के रूप में अभिकर्मकों के साथ लाइव सेल इमेजिंग है. सेलटिटर-ग्लो 3 डी और एओपीआई का हमारा तुलनात्मक विश्लेषण, जिनमें से उत्तरार्द्ध सेल लसीका की आवश्यकता नहीं है, सेल व्यवहार्यता और मृत्यु (चित्रा 6सी) के आकलन के लिए पीडीओ मॉडल में लाइव-सेल इमेजिंग रंगों का उपयोग करने के फायदों पर प्रकाश डाला गया है। इस विधि को हमारे सहित कई समूहों द्वारा लागू किया गया है, एक प्रयोग 18,19,20के समापन पर फेनोटाइपिक प्रभाव का आकलन करने के लिए. हालांकि, या तो अच्छी तरह से निर्धारण या समापन बिंदु लाइव-सेल इमेजिंग विधियों का उपयोग करके गतिज डेटा अधिग्रहण के लिए महत्वपूर्ण नमूने की आवश्यकता होती है। भाग में समय के साथ पीडीओ के लेबल मुक्त morphologic मूल्यांकन इस सीमा पर काबू पाने और इमेजिंग तौर-तरीकों 8,10,17,18 की एक विस्तृत श्रृंखला का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है, अभी तक आकृति विज्ञान में परिवर्तन एपोप्टोसिस और सेल व्यवहार्यता में परिवर्तन के रूप में संभावित दवा प्रभाव के स्पेक्ट्रम के प्रतिनिधि नहीं हो सकता है. हमने दवाओं के जवाब में रूपात्मक परिवर्तनों में महत्वपूर्ण मॉडल-टू-मॉडल परिवर्तनशीलता देखी है। उदाहरण के लिए, कुछ पीडीओ क्षेत्र में बढ़ेंगे क्योंकि वे एपोप्टोसिस से गुजर रहे हैं, जबकि अन्य मॉडल सिकुड़ सकते हैं। काइनेटिक रूपात्मक आकलन अध्ययन18,20 की एक सीमित संख्या में या तो तय या लाइव सेल फ्लोरोसेंट समापन बिंदु assays के साथ multiplexed किया गया है. इस के साथ साथ साथ प्रस्तुत तरीकों एक उच्च throughput प्रणाली में कई सेलुलर प्रभाव का आकलन करने के लिए एक साथ विभिन्न फ्लोरोसेंट रंजक मल्टीप्लेक्स करने के लिए पहले के बीच में हैं.

काइनेटिक लाइव-सेल इमेजिंग द्वारा प्रदान किए गए सबसे बड़े सुधारों में से एक यह है कि यह समापन बिंदु परख से जुड़ी प्रमुख सीमाओं पर काबू पाता है। उदाहरण के लिए, अच्छी तरह से प्रति पीडीओ की एक समान संख्या चढ़ाना तकनीकी रूप से मुश्किल है क्योंकि सबसे स्वचालित सेल काउंटर 60 माइक्रोन से छोटी वस्तुओं के लिए gated हैं. लाइव-सेल इमेजिंग प्रत्येक कुएं में 0 घंटे के समय पीडीओ संख्या या क्षेत्र के लिए सामान्यीकरण की अनुमति देता है, जिसका उपयोग कुओं के बीच चढ़ाना में भिन्नता के लिए समायोजित करने के लिए किया जा सकता है। पीडीओ के लिए स्वर्ण मानक समापन बिंदु परख सेलटिटर-ग्लो 3 डी किट है, जो एटीपी को सेल व्यवहार्यता के लिए सरोगेट के रूप में मापता है। हमने स्त्री रोग संबंधी और प्रोस्टेट कैंसर पीडीओ 13,21,22,23,24के हमारे अध्ययन में इस परख का व्यापक रूप से उपयोग किया है। एटीपी उपायों के लिए सेल लाइसिस की आवश्यकता के अलावा, दवाएं और अन्य चिकित्सीय तौर-तरीके एटीपी स्तरों को बदल सकते हैं, संभावित रूप से चिकित्सीय प्रतिक्रिया का गलत मूल्यांकन प्रदान कर सकते हैं। लाइव-सेल इमेजिंग रंगों का उपयोग विशिष्ट सेलुलर प्रतिक्रियाओं के व्यापक दायरे की मात्रा का ठहराव करने की अनुमति देता है, जैसे कि एपोप्टोसिस और साइटोटॉक्सिसिटी। महत्वपूर्ण रूप से, ये अभिकर्मक सेल व्यवहार्यता को परेशान नहीं करते हैं या डीएनए क्षति को प्रेरित नहीं करते हैं, जैसा कि प्रोपिडियम आयोडाइड के मामले में है; यह समय के साथ पीडीओ प्रतिक्रिया के बार-बार मूल्यांकन की अनुमति देता है। जबकि हमने गतिज उपायों के लिए एक्रिडिन ऑरेंज (एओ) के उपयोग का पता नहीं लगाया है, एओ के लिए कार्रवाई का तंत्र भविष्य में इस तरह के आवेदन को रोकना नहीं चाहिए।

ट्यूमर में अलग-अलग जीनोमिक प्रोफाइल और आकृति विज्ञान के साथ कई अलग-अलग सेल आबादी होती है। पीडीओ मॉडल की जटिल विविधता के कारण, व्यक्तिगत पीडीओ प्रतिक्रियाएं भिन्न हो सकती हैं, और इन प्रतिक्रियाओं को ट्रैक करना चुनौतीपूर्ण है। हमारा प्रोटोकॉल एक अच्छी तरह से आधार पर कई पीडीओ प्रतिक्रिया मैट्रिक्स का आकलन करने के लिए एक विधि प्रदान करता है। हालांकि, कुछ तकनीकी विचार अभी भी लाइव-सेल इमेजिंग पर लागू होते हैं। एक 24 अच्छी तरह से थाली बीज एक 96 अच्छी तरह से थाली के कुओं की संख्या घनत्व और प्रत्येक पीडीओ मॉडल की विकास दर पर निर्भर करेगा. क्योंकि क्लंपिंग छवि विश्लेषण (पूरक चित्रा 4) को भ्रमित कर सकता है, पीडीओ मॉडल को चढ़ाना से पहले अतिरिक्त प्रसंस्करण चरणों की आवश्यकता हो सकती है। यदि आवश्यक हो, तो पीडीओ यंत्रवत् एक गैर चौड़ा बोर p200 टिप के साथ जोरदार pipetting के माध्यम से प्रसंस्करण के दौरान कतरनी किया जा सकता है. TrypLE एक्सप्रेस का उपयोग एंजाइमी पाचन भी पीडीओ पृथक्करण को बढ़ावा देने और क्लंपिंग में कमी को बढ़ावा देने के लिए चढ़ाना से पहले नियोजित किया जा सकता है। हमारे अनुभव में, हमने नोट किया है कि मॉडल के आधार पर ट्रिपल इनक्यूबेशन की लंबाई अत्यधिक परिवर्तनशील है। इसलिए, TrypLE इनक्यूबेशन प्रत्येक मॉडल के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए, खासकर अगर शोधकर्ताओं एकल सेल निलंबन प्राप्त करना चाहते हैं. उपचार शुरू करने से पहले रिकवरी समय पीडीओ मॉडल के लिए आवश्यक हो सकता है जो विशेष रूप से एंजाइमी पाचन के प्रति संवेदनशील होते हैं।

हम विशिष्ट लाइव सेल इमेजिंग अभिकर्मकों के लिए तरीके प्रस्तुत करते हैं। यहां प्रस्तुत विधियों की व्यापक प्रयोज्यता में एक सीमा अभिकर्मकों की कमी है जो बीएमई के साथ संगत हैं। अन्य रंजक/अभिकर्मकों के लिए जिन्हें अभी तक पीडीओ में उपयोग के लिए अनुकूलित नहीं किया गया है, इष्टतम एकाग्रता निर्धारित करने और विलायक प्रभाव को कम करने के लिए अतिरिक्त समस्या निवारण आवश्यक हो सकता है। ब्याज के readout (जैसे, apoptosis या cytotoxicity) के आधार पर, इस तरह staurosporine या daunorubicin13 के रूप में कोशिका मृत्यु प्रेरित करने के लिए जाना जाता एक यौगिक के साथ उपचार अभिकर्मक शर्तों का अनुकूलन करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. एक अतिरिक्त विचार बीएमई गुंबद में डाई एकीकरण के लिए इष्टतम समय है। हमारे प्रयोगों में, हम उपचार से पहले एक रात भर इनक्यूबेशन प्रदर्शन गुंबदों में डाई का पूरा तेज के रूप में अच्छी तरह के रूप में आधारभूत सेल स्वास्थ्य का निर्धारण करने के लिए अनुमति देने के लिए. चूंकि सिग्नल की तीव्रता समय के साथ बढ़ेगी, इसलिए शोधकर्ताओं को ओवरएक्सपोज्ड छवियों से बचने के लिए प्रयोग के अंत में आदर्श एक्सपोजर समय निर्धारित करने के लिए रंगों के साथ पायलट अध्ययन करना चाहिए। अंत में, अभिकर्मकों को सेलुलर प्रक्रियाओं में हस्तक्षेप नहीं करना चाहिए। उदाहरण के लिए, डीएनए में इंटरकेलेट करने वाले रंजक गतिज इमेजिंग के साथ संगत नहीं हैं। हालांकि, लाइव सेल इमेजिंग समापन बिंदु assays में डेटा सामान्यीकरण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. दरअसल, हम सेल व्यवहार्यता और व्यवहार्य मात्रा निर्धारित करने के लिए एक पूरक विधि प्रस्तुत करते हैं: AOPI का उपयोग करके मृत कोशिका अनुपात। इस प्रयोग में, फ्लोरोसेंट संकेत प्रत्येक अच्छी तरह से के रूप में दिन 0 (उपचार के दिन, चित्रा 6) पर लाइव सेल इमेजिंग द्वारा निर्धारित के रूप में प्रत्येक अच्छी तरह से पीडीओ संख्या के लिए सामान्यीकृत है.

इस विधि कागज की एक और सीमा प्रयोगों के लिए मैनुअल पाइपिंग पर निर्भरता है, जिससे तकनीकी प्रतिकृतियों में अधिक भिन्नता हो सकती है। डेटा प्रजनन क्षमता में और सुधार इस तरह के चढ़ाना और दवा वितरण के लिए एक स्वचालित तरल हैंडलर के उपयोग के रूप में, इस तरह के चढ़ाना और दवा वितरण के लिए एक स्वचालित तरल हैंडलर के उपयोग के लिए स्वचालन के अलावा के साथ प्राप्त किया जा सकता है, दूसरों 8,10 द्वारा प्रदर्शन किया गया है. हालांकि, इस अतिरिक्त अनुसंधान बुनियादी ढांचे में एक अतिरिक्त निवेश की आवश्यकता है जो सभी जांचकर्ताओं के लिए उपलब्ध नहीं हो सकता है। प्रत्येक मॉडल के लिए पीडीओ क्षेत्र में विषमता को देखते हुए, प्रारंभिक पीडीओ संख्या या समय 0 घंटे पर क्षेत्र के परिणामों को सामान्य करना अभी भी स्वचालित बीजारोपण के साथ एक उपयोगी दृष्टिकोण है।

अन्य लाइव-सेल इमेजिंग प्लेटफार्मों पर साइटेशन 5 का एक प्रमुख लाभ छवि और विश्लेषण सुविधाओं को अनुकूलित करने की क्षमता है। हालाँकि, Cytation 5/Gen5 सॉफ़्टवेयर में सीखने की अवस्था तेज है और यह मानता है कि उपयोगकर्ताओं को इमेजिंग का मूलभूत ज्ञान है। इस विधियों के लक्ष्यों में से एक अन्य शोधकर्ताओं के लिए अपने पीडीओ अनुसंधान कार्यक्रमों में परिष्कृत लाइव-सेल इमेजिंग तकनीकों को शामिल करने के लिए बाधा को कम करने के लिए चरण-दर-चरण निर्देश प्रदान करना है। जबकि यहां प्रस्तुत विशिष्ट विश्लेषण चरण एक प्रणाली के लिए हैं, उपयोगकर्ता मल्टीप्लेक्सिंग सिद्धांतों को अन्य प्लेटफार्मों पर लागू कर सकते हैं, इस समझ के साथ कि डाउनस्ट्रीम विश्लेषण को एनआईएच इमेजजे जैसे तीसरे पक्ष के सॉफ़्टवेयर के उपयोग की आवश्यकता हो सकती है।

विश्लेषण मेट्रिक्स दोनों प्रयोगात्मक लक्ष्यों और चढ़ाना शर्तों के आधार पर चुना जाना चाहिए. उदाहरण के लिए, यदि प्रयोग कोशिका मृत्यु की मात्रा निर्धारित करने के लिए फ्लोरोसेंट डाई का उपयोग करके आयोजित किया जाता है, तो प्रतिदीप्ति तीव्रता एक प्रभावी रीडआउट है। सबसे प्रभावी प्रतिदीप्ति मीट्रिक (कुल प्रतिदीप्ति बनाम वस्तु मतलब तीव्रता) चढ़ाना की स्थिति (अनुपूरक चित्रा 4) पर निर्भर करेगा. यदि पीडीओ समान रूप से फैले हुए हैं और एक अधिक परिपत्र, एकजुट आकृति विज्ञान है, तो प्रतिदीप्ति एक परिभाषित पीडीओ उप-जनसंख्या में निर्धारित की जा सकती है। Gen5 सॉफ्टवेयर में विशिष्ट कार्य सेलुलर विश्लेषण है, और आउटपुट ऑब्जेक्ट मीन इंटेंसिटी है। हालांकि, अगर पीडीओ मॉडल क्लंपी है या एक disohesive आकारिकी है, हम छवि स्तर पर प्रतिदीप्ति संकेत यों की सलाह देते हैं; यह फ़ंक्शन छवि सांख्यिकी के तहत पाया जा सकता है, और आउटपुट कुल प्रतिदीप्ति तीव्रता है। हालांकि यह विधि व्यक्तिगत अच्छी तरह से स्तर पर परिवर्तनों को देखने के लिए उपयोगी है, यह मीट्रिक ब्याज की वस्तुओं के लिए विशिष्ट नहीं है और यदि पीडीओ प्रयोग की अवधि में निर्दिष्ट प्लग के बाहर जाते हैं तो गलती से बदल सकते हैं। परिदृश्यों में जिसमें महत्वपूर्ण मलबे या मृत एकल कोशिकाएं होती हैं, सेलुलर विश्लेषण का उपयोग किसी भी फ्लोरोसेंट सिग्नल को गेट करने का सुझाव दिया जाता है जो विशेष रूप से पीडीओ से जुड़ा नहीं है। सेलुलर विश्लेषण बनाम छवि सांख्यिकी का उपयोग कर अंतर परिणामों का एक उदाहरण पूरक चित्रा 5 में प्रस्तुत किया गया है.

छवि सांख्यिकी फ़ंक्शन के लिए इष्टतम सीमा निर्धारित करने के लिए, लाइन टूल का उपयोग किया जा सकता है। लाइन टूल का उपयोग करके, उपयोगकर्ता एक छवि के भीतर प्रतिदीप्ति तीव्रता की सीमा निर्धारित कर सकते हैं। हम छवि के भीतर चोटी तीव्रता के 25% मूल्य के रूप में कम सीमा सेट. फ्लोरोसेंट क्षेत्रों है कि निर्दिष्ट सीमा में शामिल हैं देखने के लिए, "थ्रेसहोल्ड आउटलायर" बॉक्स की जाँच करें. निचले थ्रेशोल्ड मान की अतिरिक्त फाइन-ट्यूनिंग आवश्यक हो सकती है।

लाइव सेल इमेजिंग में एक महत्वपूर्ण चुनौती प्रत्येक प्रयोग के साथ उत्पन्न डेटा की भारी मात्रा में भंडारण है. यह पीडीओ संस्कृतियों के मामले में विशेष रूप से प्रासंगिक है, जहां जेड-स्टैक का उपयोग कई फोकल विमानों में छवि बनाने और जेड प्रोजेक्शन उत्पन्न करने के लिए किया जाता है। इस समस्या को दूर करने के लिए कई तरीके हैं। सबसे पहले, पर्याप्त भंडारण क्षमता सुनिश्चित करें। हमने कुल 17 टीबी के साथ तीन सॉलिड-स्टेट हार्ड ड्राइव स्थापित किए हैं। अन्य विकल्पों में प्रयोगात्मक फ़ाइलों को बाहरी हार्ड ड्राइव या नेटवर्क स्टोरेज में स्थानांतरित करना शामिल है। क्लाउड आधारित संग्रहण में फ़ाइलों को सीधे लिखने की अनुशंसा नहीं की जाती है। बाहरी ड्राइव पर संग्रहीत डेटा का विश्लेषण करने के लिए, बस प्रयोग और छवि फ़ाइलों को Gen5 सॉफ़्टवेयर से लैस कंप्यूटर पर स्थानांतरित करें (नोट: बड़ी फ़ाइलों को स्थानांतरित करने में विस्तारित समय लग सकता है)। विश्लेषण से पहले, छवियों प्रयोग करने के लिए relink किया जाना चाहिए. प्रयोग फ़ाइल खोलें, टूलबार में प्रोटोकॉल पर क्लिक करें, प्रोटोकॉल विकल्प चुनें। छवि सहेजें विकल्प पर क्लिक करें और नया छवि फ़ोल्डर चुनें पर क्लिक करें। छवि फ़ाइल का पता लगाएँ और फिर से लिंक करने के लिए फ़ोल्डर का चयन करें पर क्लिक करें।

प्रयोग के लक्ष्यों के आधार पर, Gen5 के भीतर बिनिंग सुविधा का उपयोग करना भी उपयुक्त हो सकता है। बाइनिंग पिक्सेल की संख्या कम करके फ़ाइल आकार को कम करता है, जिससे छवि रिज़ॉल्यूशन कम हो जाता है (चरण 3.5.3.2 देखें)। इसलिए, उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियों की आवश्यकता होने पर बिनिंग की अनुशंसा नहीं की जाती है। बिनिंग सुविधा का उपयोग करते समय, एक्सपोज़र सेटिंग्स को समायोजित करने की आवश्यकता होगी। एक बार प्रयोगात्मक फ़ाइल बनाया गया है, छवि अनुभाग पर डबल क्लिक करें, और खुर्दबीन आइकन इमेजर मैनुअल मोड फिर से खोलने के लिए क्लिक करें. ऑटो-एक्सपोज़ फ़ंक्शन का उपयोग करें या आवश्यकतानुसार एक्सपोज़र को मैन्युअल रूप से समायोजित करें।

संक्षेप में, हम साइटोटोक्सिक एजेंटों के जवाब में पीडीओ के एपोप्टोसिस और सेल स्वास्थ्य का आकलन करने के तरीके प्रस्तुत करते हैं। भविष्य के अध्ययन तरीकों का अनुकूलन करने और पीडीओ की गतिज इमेजिंग के लिए अतिरिक्त विश्लेषण रणनीतियों को विकसित करने के लिए आवश्यक हैं, जैसे कि अन्य फेनोटाइप और दवाओं के प्रभाव जो साइटोटोक्सिक के बजाय साइटोस्टैटिक हैं। एक प्रमुख बाधा रंगों और अभिकर्मकों की व्यावसायिक उपलब्धता है जो बीएमई के साथ संगत हैं। इन मॉडलों से सबसे अधिक डेटा निकालने के लिए गतिज लाइव-सेल इमेजिंग का पूरी तरह से उपयोग कैसे किया जा सकता है, यह समझने के लिए अभी भी अधिक काम आवश्यक है।

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Disclosures

KWT Immortagen Inc. का सह-मालिक है, CJD Agilent का कर्मचारी है। JSdB ने सलाहकार बोर्डों पर काम किया है और Amgen, Astra Zeneca, Astellas, Bayer, Bioxcel Therapeutics, Boehringer Ingelheim, Cellcentric, Daiichi, Eisai, Genentech/Roche, Genmab, GSK, Harpoon, ImCheck Therapeutics, Janssen, Merck Serono, Merck Sharp & Dohme, Menarini/Silicon Biosystems, Orion, Pfizer, Qiagen, Sanofi Aventis, Sierra Oncology, Taiho, Terumo और Vertex Pharmaceuticals; इंस्टीट्यूट ऑफ कैंसर रिसर्च (आईसीआर) का एक कर्मचारी है, जिसे एजेड, एस्टेलस, बायर, सेलसेंट्रिक, दाइची, जेनेंटेक, जेनमैब, जीएसके, जानसेन, मर्क सेरोनो, एमएसडी, मेनारिनी / सिलिकॉन बायोसिस्टम्स, ओरियन, सनोफी एवेंटिस, सिएरा ऑन्कोलॉजी, ताइहो, फाइजर और वर्टेक्स से अपने शोध कार्य के लिए धन या अन्य सहायता प्राप्त हुई है, और जिसमें डीएनए मरम्मत दोषपूर्ण कैंसर में एबीरेटेरोन, पीएआरपी निषेध में व्यावसायिक रुचि है, और PI3K/AKT पाथवे इनहिबिटर (कोई व्यक्तिगत आय नहीं); एक आविष्कारक के रूप में नामित किया गया था, पेटेंट 8 822 438 के लिए कोई वित्तीय हित नहीं था, जैनसेन द्वारा प्रस्तुत किया गया था जो कॉर्टिकोस्टेरॉइड्स के साथ एबीरेटेरोन एसीटेट के उपयोग को कवर करता है; कई उद्योग-प्रायोजित नैदानिक परीक्षणों का CI/PI रहा है; और एक राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान (NIHR) के वरिष्ठ अन्वेषक हैं। किसी अन्य लेखक के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई संभावित टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम रोगी ट्यूमर के नमूने प्रदान करने के लिए आयोवा विश्वविद्यालय में ऊतक खरीद कोर और डॉ क्रिस्टन कोलमैन और पीडीओ मॉडल पीढ़ी के साथ सहायता के लिए प्रसूति और स्त्री रोग विभाग में डॉ सोफिया गैब्रिलोविच के आभारी हैं। हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण विश्लेषण के लिए डॉ. वैलेरी साल्वाटिको (एगिलेंट, यूएसए) को भी धन्यवाद देते हैं। हम निम्नलिखित फंडिंग स्रोतों को स्वीकार करते हैं: एनआईएच/एनसीआई CA263783 और डीओडी सीडीएमआरपी केडब्ल्यूटी के CA220729P1; कैंसर रिसर्च यूके, प्रोस्टेट कैंसर यूके, प्रोस्टेट कैंसर फाउंडेशन और मेडिकल रिसर्च काउंसिल से जेएसडीबी। प्रयोगों के डिजाइन या विश्लेषण या प्रकाशन के निर्णय में फंडर्स की कोई भूमिका नहीं थी।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrfuge tube Dot Scientific Inc 1008113
15 mL conical centrifuge tube Sarstedt 62.554.100
554 NM LED Cube Agilent 1225012
96-well plate Corning Costar 3596 Prewarmed to 37 °C
96-well plate Agilent 204626-100 Prewarmed to 37 °C
A83-01 Tocris 2939 Final concentration is 500 nM (component of organoid culture media)
Advanced DMEM/F-12 Gibco 12634-010 component of organoid culture media
B27 Supplement Gibco 17504044 Final concentration is 1x (component of organoid culture media)
BioTek BioSpa 8 Automated Incubator Agilent BIOSPAG-SN Tabletop incubator; BioSpa OnDemand scheduling software comunicates with Gen5 to transfer plates between the BioSpa and the Cytation 5 for imaging (this protocol uses version 1.01.10)
BioTek Cytation 5 Cell Imaging Multimode Reader Agilent CYT5PW-SN Plate reader; Gen5 software is used for this device (this protocol uses version 3.12.08)
Cultrex UltiMatrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract R&D Systems BME001-10
Daunorubicin HCl Sigma-Aldrich S3035 Reconstituted in DMSO
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D2438
EDTA (0.5 M) Thermo Fisher AM9260G
Forskolin Tocris 1099 Final concentration is 10 µM (component of organoid culture media)
Glutamax Gibco 35050-061 Final concentration is 1x (component of organoid culture media)
HEPES Gibco 15630-080 Final concentration is 10 mM (component of organoid culture media)
Human EGF, Animal-Free Recombinant Protein Gibco AF-100-15-1MG Final concentration is 0.5 ng/mL (component of organoid culture media)
Human FGF-10 Recombinant Protein Gibco 100-26-1MG Final concentration is 10 ng/mL (component of organoid culture media)
Human R-Spondin 1 Recombinant Protein Gibco 120-38-5UG Final concentration is 250 ng/mL (component of organoid culture media)
Hydrocortisone Stock Solution StemCell Technologies 7926 Final concentration is 500 ng/mL (component of organoid culture media)
Imaging Filter Cube- GFP Agilent 1225101
Imaging Filter Cube- TRITC Agilent 1225125
Imaging LED GFP/CFP Agilent 1225001
Incucyte Annexin V Red Dye Sartorius 4641 Reconstituted in organoid culture media
Incucyte Cytotox Green Dye Sartorius 4633 DMSO solution
N-Acetyl-L-cysteine Sigma-Aldrich A7250 Final concentration is 1.25 mM (component of organoid culture media)
Nexcelom Bioscience ViaStain AOPI Staining Solution Fisher-Scientific 13366169 Add 1:50 volume
Nicotinamide Sigma-Aldrich N0636 Final concentration is 10 mM (component of organoid culture media)
Noggin R&D Systems 6057-NG Final concentration is 100 ng/mL (component of organoid culture media)
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 Final concentration is 10 units/mL (component of organoid culture media)
Phosphate Buffered Saline (1x) Gibco 14190-144
Primocin InvivoGen ant-pm-05 Final concentration is 100 µg/mL (component of organoid culture media)
Recombinant Human Heregulinβ-1 Pepro Tech 100-03 Final concentration is 37.5 ng/mL (component of organoid culture media)
Staurosporine solution from Streptomyces sp. Sigma-Aldrich S6942
TrypLE Express Life Technologies 12604013
Y-27632, CAS 331752-47-7 Sigma-Aldrich 688000 Final concentration is 5 µM (component of organoid culture media)
β-Estradiol Sigma-Aldrich E2758 Final concentration is 100 nM (component of organoid culture media)

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References

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