Quantification des propriétés élastiques des biofilms environnementaux à l’aide de l’élastographie par cohérence optique

Summary

Cet article met en évidence l’efficacité de la technique d’élastographie par cohérence optique (OCE) dans la caractérisation rapide et non destructive des propriétés élastiques des biofilms. Nous élucidons les procédures critiques de mise en œuvre des OCE pour des mesures précises et présentons les valeurs du module de Young pour deux biofilms granulaires.

Abstract

Les biofilms sont des biomatériaux complexes comprenant un réseau bien organisé de cellules microbiennes enfermées dans des substances polymères extracellulaires (EPS) autoproduites. Cet article présente un compte rendu détaillé de la mise en œuvre de mesures d’élastographie par cohérence optique (OCE) adaptées à la caractérisation élastique des biofilms. L’OCE est une technique optique non destructive qui permet de cartographier localement la microstructure, la morphologie et les propriétés viscoélastiques de matériaux souples partiellement transparents avec une résolution spatiale et temporelle élevée. Nous fournissons un guide complet détaillant les procédures essentielles pour la mise en œuvre correcte de cette technique, ainsi qu’une méthodologie pour estimer le module de Young en vrac des biofilms granulaires à partir des mesures collectées. Il s’agit de la configuration du système, de l’acquisition des données et du post-traitement. Dans la discussion, nous nous penchons sur la physique sous-jacente des capteurs utilisés dans les OCE et explorons les limites fondamentales concernant les échelles spatiales et temporelles des mesures des OCE. Nous concluons avec des orientations futures potentielles pour faire progresser la technique OCE afin de faciliter les mesures élastiques des biofilms environnementaux.

Introduction

Dans le traitement des eaux usées et la récupération des ressources en eau, les biofilms bénéfiques dans les réacteurs de croissance attachés sont de plus en plus utilisés pour permettre aux microbes de convertir les polluants indésirables, tels que la matière organique, l’azote et le phosphate, en formes stabilisées qui peuvent être facilement éliminées de l’eau¹. Dans ces systèmes, la fonction émergente du biofilm, à savoir les transformations biochimiques, est étroitement associée à la diversité des microbes qui y résident et aux nutriments que ces microbes reçoivent². Par conséquent, la croissance continue du biofilm peut poser un défi pour maintenir une fonctionnalité constante du réacteur, car la croissance du nouveau biofilm peut modifier les processus métaboliques globaux du biofilm, les caractéristiques de transfert de masse et la composition de la communauté. Stabiliser autant que possible l’environnement du biofilm peut protéger contre de tels changements³. Il s’agit notamment d’assurer un flux constant de nutriments et de maintenir la structure du biofilm stable avec une épaisseur constante⁴. La surveillance de la rigidité et de la structure physique du biofilm permettrait aux chercheurs de mieux comprendre la santé et le fonctionnement globaux du biofilm.

Les biofilms présentent des propriétés viscoélastiques ^5,6,7. Cette nature viscoélastique se traduit par une combinaison d’une déformation instantanée et lente, dépendante du temps, en réponse à des forces mécaniques externes. Un aspect unique des biofilms est que, lorsqu’ils sont soumis à une déformation importante, ils réagissent comme des liquides visqueux. À l’inverse, lorsqu’ils sont soumis à une déformation mineure, leur réponse est comparable à celle des solides⁵. De plus, dans cette région de petite déformation, il existe une plage de déformation sous laquelle les biofilms présentent une relation force-déplacement linéaire ^5,6,7. Les déformations dans cette plage linéaire sont optimales pour évaluer les caractéristiques mécaniques des biofilms car elles permettent d’obtenir des mesures reproductibles. Plusieurs techniques permettent de quantifier la réponse élastique dans cette plage. L’élastographie par cohérence optique (OCE) est une technique émergente qui est en cours d’adaptation pour analyser les biofilms dans cette gamme linéaire (déformations de l’ordre de 10-4-10-5)^8,9.

L’application la plus établie d’OCE jusqu’à présent est dans le domaine biomédical, où la technique a été appliquée pour caractériser des tissus biologiques qui ne nécessitent qu’un accès optique superficiel. Par exemple, Li et al. ont utilisé l’OCE pour caractériser les propriétés élastiques du tissu cutané¹⁰. D’autres auteurs ont caractérisé les propriétés élastiques anisotropes des tissus cornéens porcins et humains et comment ils sont affectés par la pression intraoculaire 11,12,13,14,15,16. Certains avantages de la méthode OCE pour l’étude des biofilms sont qu’elle est non destructive et fournit une résolution spatiale à méso-échelle, qu’elle ne nécessite aucune préparation d’échantillon et que la méthode elle-même est rapide ; Il fournit des mesures co-enregistrées de la structure physique et des propriétés élastiques (par exemple, porosité, rugosité de surface et morphologie)8,9,17,18.

La méthode OCE mesure le déplacement local des ondes élastiques se propageant dans un échantillon à l’aide de la tomographie par cohérence optique (OCT) sensible à la phase. L’OCT est un interféromètre optique à faible cohérence qui transforme les changements locaux dans le déplacement de l’échantillon en un changement d’intensité qui est enregistré avec un spectromètre optique. La technique OCT a également été utilisée dans la recherche sur les biofilms pour la caractérisation de la structure à méso-échelle, de la distribution de la porosité en trois dimensions et de la déformation du biofilm 17,19,20,21. De plus, Picioreanu et al. ont estimé les propriétés mécaniques du biofilm en utilisant la modélisation inverse de l’interaction fluide-structure d’images de déformation en coupe transversale OCT²².

D’autre part, les mesures OCE, couplées à la modélisation des ondes élastodynamiques inverses, donnent la vitesse d’onde des ondes élastiques dans l’échantillon, ce qui permet de caractériser les propriétés élastiques et viscoélastiques de l’échantillon. Notre groupe a adapté la technique OCE pour la mesure quantitative des propriétés élastiques et viscoélastiques du biofilm ^8,9,18 et a validé la technique par rapport aux mesures de rhéométrie de cisaillement dans des échantillons de plaques de gel d’agarose¹⁸. L’approche OCE fournit des estimations précises et fiables des propriétés du biofilm puisque la vitesse d’onde élastique mesurée est corrélée aux propriétés élastiques de l’échantillon. De plus, la décroissance spatiale de l’amplitude de l’onde élastique peut être directement corrélée aux propriétés viscoélastiques dues aux effets visqueux dans le matériau. Nous avons rapporté des mesures OCE des propriétés viscoélastiques de biofilms bactériens de culture mixte cultivés sur des coupons dans un réacteur annulaire rotatif (RAR) et de biofilms granulaires à géométries complexes en utilisant des modèles d’ondes élastodynamiques¹⁸.

La technique OCE est également une alternative puissante à la rhéométrie^{traditionnelle 18}qui est utilisée pour la caractérisation viscoélastique. Les méthodes rhéométriques sont les mieux adaptées aux échantillons à géométrie plane. Ainsi, les biofilms granulaires, qui ont des formes et des morphologies de surface arbitraires, ne peuvent pas être caractérisés avec précision sur un rhéomètre ^8,23. De plus, contrairement à l’OCE, les méthodes de rhéométrie peuvent être difficiles à adapter pour les mesures en temps réel, par exemple, pendant la croissance du biofilm dans les cellules d’écoulement^24,25.

Dans cet article, nous montrons que les mesures OCE de la vitesse d’onde indépendante de la fréquence des ondes de surface peuvent être utilisées pour caractériser les propriétés élastiques du biofilm sans avoir besoin de modèles compliqués. Ce développement rendra l’approche des CEO plus accessible à l’ensemble de la communauté des biofilms pour l’étude des propriétés mécaniques des biofilms.

La figure 1 montre une illustration schématique du système OCT utilisé dans cette étude. Le système intègre plusieurs instruments, dont un système OCT commercial sensible à la phase dans le domaine spectral, un générateur de retard, un générateur de fonctions et un transducteur piézoélectrique. Le système OCT fonctionne sur le principe de l’interférométrie en utilisant une source lumineuse à large bande avec une longueur d’onde centrale de 930 nm. L’intensité lumineuse collectée, qui est corrélée aux détails structurels complexes de l’échantillon, est analysée dans l’unité de post-traitement, puis convertie en une image en coupe transversale de l’échantillon – communément appelée image OCT. La profondeur d’imagerie OCT dépend de la gravité de la diffusion optique dans l’échantillon qui provient de la variation locale de l’indice de réfraction et est limitée à 1 à 3 mm dans les tissus biologiques et les biofilms. Comme la phase optique dans l’échantillon et l’intensité de l’interférence sont modulées par le mouvement, l’OCT peut être utilisé pour détecter le déplacement local de l’échantillon. Nous exploitons la sensibilité au déplacement de l’OCT dans la méthode OCE pour suivre le champ de déplacement en régime permanent des ondes élastiques dans l’échantillon. Plus précisément, le générateur de fonctions émet une tension sinusoïdale pour piloter le transducteur piézoélectrique. Le transducteur, à son tour, s’étire et se contracte avec un historique temporel oscillatoire. Le déplacement oscillatoire de la sonde confère une force sinusoïdale à la surface de l’échantillon par le biais d’une pointe cunéiforme imprimée en 3D au sommet de la sonde, ce qui entraîne la génération d’ondes élastiques harmoniques dans l’échantillon. La pointe du coin établit un léger contact avec l’échantillon, de sorte que l’échantillon reste intact après que l’actionneur soit rétracté de la surface de l’échantillon. Pour enregistrer le déplacement local dans l’échantillon, des balayages en profondeur adjacents séparés par un délai fixe sont acquis à chaque pixel de l’échantillon. La différence de phase optique entre les balayages consécutifs à chaque point de pixel est proportionnelle au déplacement vertical local au même point. La synchronisation entre le déplacement du transducteur et l’optique de balayage dans le système OCT est réalisée par une impulsion de déclenchement qui provient du générateur de fonctions et est retardée dans le générateur de retard. Cette étape de synchronisation facilite l’acquisition d’images transversales cohérentes de la distribution de phase optique locale dans l’échantillon. Ces images sont directement proportionnelles au déplacement harmonique vertical local dans l’échantillon et sont connues sous le nom d’image OCE. Les images OCE sont acquises à différentes fréquences d’actionnement du transducteur pour obtenir la longueur d’onde élastique et la vitesse d’onde en fonction de la fréquence. Les vitesses d’onde mesurées sont analysées avec un modèle élastodynamique pour déterminer les propriétés élastiques de l’échantillon.

Protocol

1. Configuration du système Rassemblez les composants du système, notamment le système OCT commercial (unité de base, support, tête d’imagerie et ordinateur), le générateur de formes d’onde, le transducteur, le générateur de retard/impulsions, un commutateur avec connexions BNC, des câbles et adaptateurs BNC, des bornes optiques et des pinces. Connectez le signal de synchronisation du générateur de fonctions à un interrupteur. Connectez l’autre port du commutateur a…

Representative Results

Dans cette étude, nous avons utilisé des biofilms granulaires (également appelés boues granulaires), qui ont été obtenus commercialement. Les granulés sont des biofilms sphériques qui se forment par auto-agrégation, ce qui signifie qu’ils n’ont pas besoin d’un support ou d’une surface sur laquelle se développer26. La figure 3A montre une image OCT en coupe transversale représentative qui résulte de la variation spatiale de l’ind…

Discussion

La profondeur d’imagerie réalisable dans le système OCT est déterminée par le degré de pénétration de la lumière de la source lumineuse, qui dépend de la longueur d’onde de la source. De plus, la longueur d’onde détermine la résolution axiale. Les longueurs d’onde plus longues peuvent pénétrer plus profondément dans l’échantillon, mais au détriment d’une résolution axiale réduite par rapport aux longueurs d’onde plus courtes. La résolution transversale, en revanche, dépend à la fois de …

Materials

3D printed sample holder
3D printed wedge tip			3 mm width
BNC cables	Any brand
Delay generator	Stanford Research Systems	DG535	DG535 Digital delay/ Pulse Generator
Function generator	Agilent Technologies		33250A 80 MHz Function / Arbitrary Waveform Generator
Granular biofilm	Aqua-Aerobic Systems		Obtained from an Aerobic Granular Sludge reactor (Aqua-Aerobic Systems, Inc.)
MATLAB	MathWorks		Release 2022a (MATLAB 9.12)
Piezoelectric transducer	Thorlabs	PK2JUP1	Discrete Piezo Stack, 75 V, 30.0 µm Displacement
SD-OCT System	Thorlabs		Ganymede II, LSM03 scan lens
ThorImageOCT	Thorlabs		Version: 5.5.5