Summary
Viene fornito un protocollo passo-passo per la fabbricazione di griglie di affinità per streptavidina da utilizzare in studi strutturali di campioni macromolecolari impegnativi mediante microscopia crioelettronica.
Abstract
Le griglie di affinità della streptavidina forniscono strategie per superare molte sfide comunemente incontrate nella preparazione dei campioni di microscopia crioelettronica (cryo-EM), tra cui la denaturazione del campione e gli orientamenti preferenziali che possono verificarsi a causa dell'interfaccia aria-acqua. Le griglie di affinità della streptavidina, tuttavia, sono attualmente utilizzate da pochi laboratori crio-EM perché non sono disponibili in commercio e richiedono un attento processo di fabbricazione. I cristalli bidimensionali di streptavidina vengono coltivati su un monostrato lipidico biotinilato che viene applicato direttamente alle griglie crio-EM standard a carbone forato. L'interazione ad alta affinità tra streptavidina e biotina consente il successivo legame di campioni biotinilati che sono protetti dall'interfaccia aria-acqua durante la preparazione del campione crio-EM. Inoltre, queste griglie forniscono una strategia per concentrare i campioni disponibili in quantità limitate e purificare i complessi proteici di interesse direttamente sulle griglie. Qui, viene fornito un protocollo ottimizzato passo dopo passo per la robusta fabbricazione di griglie di affinità per la streptavidina da utilizzare in esperimenti crio-EM e di colorazione negativa. Inoltre, è inclusa una guida alla risoluzione dei problemi per le sfide comunemente riscontrate per rendere l'uso delle griglie di affinità della streptavidina più accessibile alla più ampia comunità crio-EM.
Introduction
La criomicroscopia elettronica (cryo-EM) ha rivoluzionato il campo della biologia strutturale consentendo la determinazione della struttura macromolecolare di campioni grandi, flessibili ed eterogenei che in precedenza erano inaccessibili con la cristallografia a raggi X o la risonanza magnetica nucleare1. Questo metodo funziona congelando le macromolecole in soluzione per creare un sottile strato di ghiaccio vitreo che può essere successivamente ripreso utilizzando un microscopio elettronico. Negli ultimi anni, i progressi significativi sia nell'hardware del microscopio che nel software di elaborazione delle immagini hanno ulteriormente ampliato i tipi di campioni adatti alla determinazione della struttura ad alta risoluzione mediante crio-EM.
Tuttavia, la preparazione di campioni sottili e vetrificati rimane una delle fasi più critiche nella determinazione della struttura macromolecolare mediante crio-EM. I campioni biologici sono spesso dinamici, fragili, soggetti a denaturazione e talvolta sono disponibili solo in piccole quantità per gli studi crio-EM. Durante il processo di blotting, queste particelle interagiscono con l'interfaccia idrofobica aria-acqua, il che può portare a orientamenti preferiti dalle particelle, disassemblaggio di complessi fragili, denaturazione parziale o completa del campione e aggregazione 2,3,4. L'uso di detergenti o altri tensioattivi, la reticolazione chimica e l'adsorbimento dei campioni per sostenere gli strati sono strategie comuni per preservare i campioni biologici durante il processo di congelamento. Gli strati di supporto come l'ossido di grafene 5,6,7 o il carbonio amorfo8 funzionano anche per concentrare le particelle sulla griglia per adsorbimento quando il campione è disponibile in quantità limitate. Tuttavia, questi metodi non sono generali o affidabili e l'ottimizzazione della preparazione della rete può richiedere molto tempo o fallire del tutto.
Le griglie di affinità della streptavidina 9,10 sono state sviluppate per superare queste carenze e per fornire un metodo blando e generalmente applicabile per sequestrare il complesso di interesse e proteggerlo dall'interfaccia aria-acqua. Queste griglie utilizzano un reticolo cristallino di streptavidina bidimensionale (2D) coltivato su un monostrato di lipidi biotinilati sulla griglia. Dopo che i campioni sono stati a loro volta biotinilati (spesso in modo sparso e casuale, il che significa in media una biotina per complesso), possono essere applicati alla griglia rivestita di streptavidina. Poiché l'adsorbimento del campione si basa sull'affinità estremamente elevata tra streptavidina e biotina, con queste griglie è possibile utilizzare concentrazioni di campione fino a 10 nM. I kit di biotinilazione disponibili in commercio per le proteine e i primer biotinilati per i complessi contenenti DNA rendono relativamente facile attaccare le parti di biotina necessarie alla maggior parte dei campioni di interesse. Oltre a concentrare il campione e tenerlo lontano dalla dannosa interfaccia aria-acqua durante il blotting, la biotinilazione casuale di uno o pochi residui di lisina può migliorare significativamente la gamma di orientamenti della molecola di interesse sulla griglia crio-EM, come dimostrato in una serie di studi11. Mentre il segnale proveniente dal cristallo di streptavidina sottostante è presente nelle immagini grezze, gli schemi di elaborazione dei dati che coinvolgono la filtrazione di Fourier delle nitide riflessioni di Bragg dal cristallo possono essere facilmente rimossi durante l'elaborazione iniziale dei dati, consentendo in ultima analisi ricostruzioni ad alta risoluzione del campione di interesse 11,12,13. In questo caso, viene fornito un protocollo ottimizzato e passo-passo per la produzione robusta di griglie di affinità streptavidina e il successivo utilizzo in esperimenti crio-EM. Il protocollo fornito dovrebbe essere completato in un periodo di 2 settimane (Figura 1A). Le prime parti del protocollo descrivono la preparazione dei reagenti, il pretrattamento delle griglie e le prime fasi di evaporazione del carbonio. Successivamente, vengono descritte le istruzioni per la preparazione del monostrato lipidico e la crescita dei cristalli di streptavidina sulle griglie EM. Inoltre, vengono fornite istruzioni per l'uso delle griglie di affinità della streptavidina negli esperimenti EM e crio-EM con colorazione negativa. Infine, vengono fornite procedure per rimuovere il segnale della streptavidina dalle micrografie una volta acquisiti i dati crio-EM.
Protocol
1. Preparazione dei reagenti
- Diluire la streptavidina acquistata commercialmente a una concentrazione finale di 0,5 mg/mL in tampone di cristallizzazione (50 mM HEPES pH 7,5, 150 mM KCl, 5 mM EDTA, 10% trealosio). Assicurati che la concentrazione finale di trealosio sia del 10%. Congelare aliquote di 25-50 μL in azoto liquido e conservare a -80 °C.
- Sciogliere il sale sodico di 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-(biotinil) in solvente 65:35:8 v/v/v cloroformio/metanolo/acqua per una concentrazione lipidica finale di 1 mg/mL. Conservare aliquote monouso da 20-30 μL a -80 °C in flaconcini di vetro.
NOTA: La preparazione del solvente è più accurata se eseguita a peso. Innanzitutto, combinare 1,85 g di acqua ultrapura con 6,41 g di metanolo per cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) e aggiungerlo a 22,42 g di cloroformio per preparare il solvente.
ATTENZIONE: Si prega di leggere e comprendere le schede di sicurezza dei produttori e le istruzioni raccomandate per la manipolazione e lo smaltimento dei solventi organici a cloroformio e metanolo prima di iniziare questo protocollo. Evitare il contatto diretto del metanolo con la pelle.
2. Pretrattamento delle griglie
- Lavare il foglio di carbonio su griglie a rete dorata immergendolo due volte nel cloroformio al 100% e una volta nell'etanolo al 100%. Metti le griglie su carta da filtro pulita ad asciugare. Ripetere il processo di lavaggio per un totale di tre cicli.
NOTA: Il successo riproducibile è stato ottenuto con griglie in lamina di carbonio disponibili in commercio che hanno un film di carbonio di carbonio spesso 10-12 nm (vedi elenco dei materiali) con dimensioni dei fori che vanno da 0,6 a 2 μm. Sono state utilizzate con successo anche griglie in lamina d'oro disponibili in commercio e griglie in carbonio forato fatte in casa preparate seguendo il protocollo di nanofabbricazione14 del Laboratorio Rubinstein. Risultati meno riproducibili sono stati ottenuti con griglie disponibili in commercio che hanno film di carbonio più sottili. Non utilizzare griglie di rame, poiché il rame reagisce con eventuali ammine organiche che potrebbero essere presenti nel campione. - Dopo che le griglie si sono asciugate, far evaporare uno strato di carbonio spesso 2,5-5 nm sul lato di carbonio delle griglie di carbonio forato. Lo spessore del carbonio è controllato con la misurazione dello spessore del film di cristallo di quarzo incorporata nell'evaporatore di carbonio fornito nel file della tabella dei materiali .
- Lascia che il carbonio appena evaporato invecchi (cioè diventi più idrofobo) per 1 settimana.
3. Preparazione del reticolo di streptavidina
NOTA: Per far crescere cristalli di streptavidina 2D sulle griglie EM holey-carbon, in primo luogo, viene applicato un monostrato lipidico biotinilato ai fori del film di carbonio (Figura 1B) mediante trasferimento Langmuir-Schaefer. Il monostrato lipidico si forma seguendo i passaggi successivi (Figura 2). Il talco crea un confine tra l'olio di ricino e la capsula di Petri e un sottile strato di olio di ricino aiuta a mantenere costante la pressione superficiale quando si forma il monostrato lipidico. Il lato contenente il carbonio evaporato dalla fase 2.2 viene utilizzato per raccogliere il monostrato, i lipidi in eccesso vengono lavati via con un tampone di cristallizzazione e la soluzione di streptavidina viene incubata sulla griglia per la cristallizzazione.
- Pulisci l'area del banco con etanolo al 70%.
- Sciacquare più volte una siringa di vetro da 5 μL con cloroformio per pulire. Lasciare asciugare completamente la siringa prima dell'uso.
- Lavare nuovamente le griglie evaporate al carbonio, cioè poco prima dell'uso, immergendole in etanolo al 100%. Lasciare asciugare le griglie su carta da filtro pulita.
- Mentre le griglie si asciugano, lava ogni pinzetta anticapillare con il 100% di cloroformio e il 100% di etanolo. Lasciare asciugare completamente le pinzette.
- Sul lato pulito del parafilm, preparare tre gocce da 50 μL di tampone di cristallizzazione (50 mM HEPES pH 7,5, 150 mM KCl, 5 mM EDTA, 10% trealosio) per ogni griglia che verrà realizzata.
- Riempire il coperchio di una capsula di Petri non rivestita da 35 mm con tampone di cristallizzazione (50 mM HEPES pH 7,5, 150 mM KCl, 5 mM EDTA, 10% trealosio). Pulisci la superficie con carta per lenti.
- Cospargere di borotalco di grado scientifico lungo il perimetro della capsula di Petri. Questo serve successivamente come indicatore, nella fase successiva, di quanto l'olio di ricino si è diffuso. Aggiungi abbastanza borotalco per creare una barriera che protegga l'olio di ricino dal toccare il bordo della capsula di Petri. L'aggiunta di troppo borotalco limita lo spazio disponibile per rendere il monostrato lipidico.
- Immergere un puntale per pipetta da 200 μL nell'olio di ricino per ottenere una goccia di medie dimensioni (circa 20 μL) che pende dal puntale della pipetta. Toccare questa goccia con la superficie del tampone nella capsula di Petri, dove si diffonderà per formare una pellicola uniforme. Il film sottile di olio risultante funge da pistone15, che mantiene una pressione superficiale costante quando si forma un monostrato lipidico (passaggio 3.10).
NOTA: È importante aggiungere abbastanza olio di ricino piuttosto che troppo poco, ed è meglio aggiungerlo come una singola goccia. Lasciare che l'olio di ricino si diffonda completamente prima di creare il monostrato lipidico. - Sciacquare la siringa di vetro da 5 μL una o due volte con il lipide disciolto prima di prelevare un'aliquota per l'uso. Evitare di creare bolle d'aria nel lipide che riempie la siringa.
NOTA: La siringa di vetro viene risciacquata con lipidi disciolti nel caso in cui rimangano residui di cloroformio dal passaggio 3.2. Il cloroformio residuo può influire sulla qualità del monostrato risultante. - Erogare il volume più piccolo possibile (~0,5 μL) di lipidi dalla siringa e toccare delicatamente la gocciolina appesa sulla superficie del film di olio di ricino. Si noti che la soluzione lipidica rompe il film di olio di ricino nel punto di contatto e che il monostrato lipidico risultante forma un cerchio al centro del film sottile di olio di ricino.
- Aggiungi diverse gocce di lipide in sequenza o aggiungi più lipidi dopo aver creato alcune griglie, ma se ne viene aggiunto troppo, il lipide si diffonderà oltre il confine dell'olio di ricino e nel perimetro in cui sono stati sequestrati il talco e qualsiasi tensioattivo contaminante. In tal caso, sarà necessario riavviare il processo.
- Prendi una griglia con una pinzetta anticapillare in modo che il braccio dritto della pinzetta e il lato evaporato di carbonio della griglia siano entrambi rivolti verso il monostrato.
- Trasferire parte del monostrato sul carbonio bucato toccando il lato evaporato del carbonio della griglia sul monostrato per 1-2 s.
NOTA: Il trasferimento riuscito è indicato dalla superficie della griglia che diventa idrofila, causando un sottile cappuccio sferico di tampone che copre l'intera griglia dopo che è stata sollevata dalla capsula di Petri. - Toccare il cappuccio sferico del tampone che ora aderisce alla griglia, in sequenza per 1 s ciascuno, alle tre gocce da 50 μL di tampone di cristallizzazione che sono state preparate sul parafilm al punto 3.5.
NOTA: Questo passaggio cerca di rimuovere il più possibile il lipide in eccesso, che copre la superficie del cappuccio sferico (piuttosto che il film di carbonio precedentemente idrofobico), al fine di evitare la formazione di vescicole lipidiche quando i campioni vengono visualizzati al microscopio elettronico. - Aggiungere con cautela 4 μL di streptavidina 0,5 mg/mL nel cappuccio sferico rimanente del tampone di cristallizzazione sulla griglia.
- Posizionare la griglia in una camera di umidità. Ripetere i passaggi 3.11-3.14 per l'intero lotto di griglie.
- Incubare le griglie a temperatura ambiente (RT) per 2 ore all'interno di una camera di umidità per evitare l'evaporazione.
NOTA: È importante che il lato oro della griglia non si bagni in nessun punto dopo l'applicazione del monostrato. - Dopo l'incubazione di 2 ore, preparare una goccia da 300 μL di tampone di risciacquo (10 mM HEPES, pH 7,5, 50 mM KCl, 5 mM EDTA, 10% trealosio) per ciascuna griglia sul lato pulito del parafilm.
NOTA: Il tampone di risciacquo contiene 50 mM KCl anziché 150 mM KCl, che si trova nel tampone di cristallizzazione utilizzato per i passaggi 3.5-3.6. - Lavare la streptavidina in eccesso (non legata) posizionando la griglia sulla goccia da 300 μL di tampone di risciacquo. Eseguire i passaggi da 3.18 a 3.20 per una griglia alla volta. Evitare di lasciare le griglie sulla goccia tampone di risciacquo da 300 μL per lunghi periodi di tempo.
NOTA: Viene eseguito un solo lavaggio perché il cristallo/monostrato di streptavidina è fragile a questo punto. Ogni volta che una griglia viene sollevata dalla superficie di una goccia di tampone di lavaggio, il ponte liquido tra la griglia e la goccia di lavaggio si rompe. Al momento della rottura, viene applicato un gradiente di pressione transitorio (pressione di aspirazione) ai cristalli monostrato autoportanti che attraversano i fori aperti del film di carbonio. Si prevede che questa pressione di aspirazione provochi un cuping transitorio del cristallo monostrato, accompagnato da un'espansione dell'area coperta dai cristalli. Se l'aumento dell'area supera il limite elastico del cristallo, il cristallo può fratturarsi o disordinarsi. - Asciugare immediatamente le pinzette anticapillari con un panno privo di lanugine per facilitare il rilascio della griglia sulla carta da filtro nel passaggio successivo. Raccogli la griglia che galleggia sulla goccia di tampone di risciacquo inserendo il braccio attorcigliato della pinzetta anticapillare nella goccia.
- Asciugare delicatamente il tampone in eccesso dal lato con carta da filtro. Posizionare la griglia su carta da filtro con il lato dorato rivolto verso il basso, ripetere i passaggi 3.18-3.20 per ciascuna griglia e lasciare asciugare le griglie per 15-20 minuti.
- Dopo che le griglie sono asciutte, capovolgile in modo che il lato dorato sia rivolto verso l'alto. Evaporare un sottile strato di carbonio (circa 0,5-2 nm di spessore) sul lato dorato delle griglie.
NOTA: Conservare le griglie a un'umidità costante, il cui valore non sembra avere importanza, notando che si prevede che più cambiamenti nell'umidità relativa provochino cicli di espansione e contrazione. Lasciare invecchiare le griglie per 1 settimana prima dell'uso crio-EM per ottenere i migliori risultati perché l'idrofobicità del lato posteriore della griglia può essere importante per la stabilità del monostrato. Le griglie sono stabili per lunghi periodi di tempo, ma dopo 3 mesi, il carbonio posteriore può diventare meno idrofobico.
4. Controllo della qualità del lotto della griglia di affinità della streptavidina mediante colorazione negativa
- Preparare due gocce da 50 μL e una goccia da 100 μL di tampone campione (50 mM HEPES pH 7,5, 50 mM KCl, 0,5 mM TCEP) sul lato pulito del parafilm.
- Rimuovere le griglie di trealosio e reidratare le streptavidine toccando le due gocce da 50 μL e lasciare galleggiare la griglia sulla goccia da 100 μL di tampone campione per 10 minuti.
NOTA: È meglio evitare l'uso di detergenti durante la reidratazione e le successive incubazioni di legame del campione. Il tampone si disperde sul lato dorato delle griglie e limita l'efficienza dei lavaggi per rimuovere i campioni in eccesso. - Dopo la reidratazione, prelevare la griglia con una pinzetta anticapillare in modo che il braccio attorcigliato della pinzetta anticapillare sia nella goccia.
- Tamponare delicatamente il tampone in eccesso e riapplicare rapidamente 4 μL di campione da 75-100 nM (opzionale).
NOTA: Evitare di lasciare asciugare la griglia dopo la reidratazione. - Incubare il campione in una camera di umidità per 1-5 minuti.
NOTA: I tempi di concentrazione e di incubazione dipendono dal campione e devono essere ottimizzati. La concentrazione del campione e il tempo di incubazione forniti sono punti di partenza suggeriti. - Sul lato pulito del parafilm, posizionare quattro gocce da 30 μL ciascuna di tampone campione e colorante di formiato di uranile (UF) all'1%.
NOTA: Si prega di leggere e comprendere le schede di sicurezza dei produttori e le istruzioni raccomandate per la manipolazione e lo smaltimento del formiato di uranile prima di eseguire questo passaggio. Il formiato di uranile è un composto tossico e radioattivo. Assicurarsi di ottenere l'approvazione preventiva dell'ente per l'uso di materiale radioattivo. - Lavare via il campione non legato toccando ciascuna delle quattro gocce di tampone campione.
- Colorare il campione utilizzando le procedure standard di colorazione negativa con UF. Tamponare delicatamente la macchia UF dal lato, lasciando uno strato molto spesso di macchia sulla griglia. È possibile applicare altri 0,5 μL di colorante alla griglia dopo l'asciugatura per rendere il colorante più spesso, se necessario. Lasciare asciugare la griglia all'aria.
NOTA: Poiché le griglie di streptavidina sono molto idrofile, la macchia negativa tende a formare una pellicola molto uniforme ovunque, contrariamente a quanto si vede comunemente quando si utilizzano griglie di carbonio continue trattate con scarico luminoso. Di conseguenza, si consiglia di lasciare un film più spesso di soluzione antimacchia.
5. Congelamento delle griglie di affinità della streptavidina con campioni biotinilati
NOTA: La seguente procedura è prevista per uno stantuffo automatizzato su un lato che contiene un sensore di tamponamento interno (è possibile anche l'asciugatura manuale su un lato in altri apparecchi di tamponamento automatizzati)
- Preparare due gocce da 50 μL e una goccia da 100 μL di tampone campione (ad es. 50 mM HEPES pH 7,5, 50 mM KCl, 0,5 mM TCEP) sul lato pulito del parafilm.
- Reidratare le griglie di streptavidina toccando le due gocce da 50 μL e lasciare galleggiare la griglia sulla goccia da 100 μL di tampone campione per 10 minuti.
- Dopo la reidratazione, prelevare la griglia con una pinzetta anticapillare in modo che il braccio attorcigliato della pinzetta anticapillare sia nella goccia.
- Tamponare delicatamente il tampone in eccesso lontano lateralmente e applicare rapidamente 4 μL di campione da 75-100 nM.
- Incubare il campione in una camera di umidità per 1-5 minuti.
NOTA: Anche in questo caso, i tempi di concentrazione e incubazione dipendono dal campione e devono essere ottimizzati. La concentrazione del campione e il tempo di incubazione forniti sono punti di partenza suggeriti. Per i campioni a basse concentrazioni, è possibile incubare per periodi di tempo più lunghi e/o legare il campione alle griglie più volte. - Preparare due gocce da 10 μL di tampone di congelamento (ad es. 50 mM HEPES pH 7,5, 50 mM KCl, 0,5 mM TCEP, 3% trealosio, 0,01% NP40) sul lato pulito del parafilm. Dopo l'incubazione, lavare il campione non legato toccando la griglia con la prima goccia del tampone di congelamento. Rilascia la griglia sulla seconda goccia del buffer di congelamento.
- Afferra rapidamente il bordo della griglia con le pinzette attaccate allo stantuffo automatizzato su un lato. Eliminare delicatamente il tampone in eccesso e applicare rapidamente 4 μL di tampone di congelamento (50 mM HEPES pH 7,5, 50 mM KCl, 0,5 mM TCEP, 3% trealosio, 0,01% NP40) alla griglia.
- Fissare le pinzette allo stantuffo automatizzato su un lato. I migliori risultati sono stati ottenuti utilizzando un sensore di blot che rileva la goccia di liquido sulla griglia con tempi di blot compresi tra 4-6 s. Le condizioni variano a seconda del campione e del tampone utilizzati.
6. Elaborazione dei dati di film crio-EM raccolti da griglie di affinità streptavidina
La raccolta dei dati sulle griglie di affinità della streptavidina può essere eseguita come con le griglie standard e non sono necessarie regolazioni speciali al microscopio. Tuttavia, la procedura qui descritta rimuove il segnale della streptavidina solo dopo la correzione del movimento della micrografia. Pertanto, le fasi di elaborazione dei dati, come la lucidatura delle particelle, che si basano sui fotogrammi originali del filmato, non possono essere eseguite in modo affidabile. La sottrazione del segnale della streptavidina (necessaria per tutte le elaborazioni standard a valle, ad eccezione della stima CTF) richiede Matlab versione R2014b o successiva in esecuzione in ambiente Linux. La sottrazione del segnale si basa sulla natura cristallina dello strato di streptavidina, che consente il mascheramento del picco e, quindi, la rimozione del segnale dalla trasformata di Fourier di ciascuna micrografia.
- Impostazione degli script di elaborazione
- Copiare tutti i file da File supplementari in una cartella dedicata all'interno della directory del progetto
- Preparare una directory denominata processing_scripts che includa i seguenti file:
lsub.m (Supplemental Coding File 1; lo script di sottrazione)
process_subtration.sh (Supplemental Coding File 2; script wrapper che esegue il ciclo su tutte le micrografie disponibili, genera lavori paralleli e tiene traccia dell'input e dell'output)
process_subtraction.cfg (Supplemental Coding File 3; file di configurazione che contiene i parametri per il lavoro di sottrazione, vedere 6.2) - Preparare una directory denominata support_scripts che includa i seguenti file:
bg_drill_hole.m (File di codifica supplementare 4)
bg_FastSubtract_standard.m (File di codifica supplementare 5)
bg_Pick_Amp_masked_standard.m (file di codifica supplementare 6)
bg_push_by_rot.m (File di codifica supplementare 7)
ReadMRC.m (file di codifica supplementare 8)
WriteMRC.m (file di codifica supplementare 9)
WriteMRCHeader.m (file di codifica supplementare 10)
- Regolare il file di configurazione in base alle esigenze (process_subtraction.cfg, (fare riferimento alla Figura 3) in base alle esigenze:
- Input: percorso della directory che contiene le micrografie corrette per il movimento in formato mrc. Utilizzare una directory o un modello che includa caratteri jolly (?, *).
Esempio:
input="/percorso/della/project_directory/micrografie/"
o
input="/percorso/della/project_directory/micrografie/*.mrc" - output_dir: Percorso della directory in cui devono essere scritte le micrografie sottratte dal reticolo.
- only_do_unfinished: Specificare (true|false) se le micrografie sottratte preesistenti devono essere sovrascritte o saltate. Questo parametro è utile per avviare lo script di sottrazione del reticolo nel bel mezzo di una sessione di microscopio (default: true).
- num_parallel_jobs: specificare il numero di processi paralleli. Questo numero dipende dalle specifiche hardware utilizzate per l'elaborazione e non deve essere superiore al numero di core disponibili. Su sistemi con 32 core e un file system di rete, sono state ottenute prestazioni ottimali con 14 processi paralleli. Per ottenere prestazioni ottimali, ottimizzare questo valore con un sottoinsieme di micrografie.
- Pad_Origin_X: 200 per un rivelatore K3 con orientamento verticale (larghezza < altezza dell'immagine) o quando si utilizza un rivelatore quadrato (Falcon III, Falcon IV, K2), 1000 per un rivelatore K3 con orientamento orizzontale (larghezza > altezza dell'immagine). La FFT viene eseguita in scatole quadrate ed è necessaria l'imbottitura se il rilevatore ha dimensioni non quadrate.
- Pad_Origin_Y: 1000 per un rivelatore K3 con orientamento verticale (larghezza < altezza dell'immagine), 200 quando si utilizza un rivelatore quadrato (Falcon III, Falcon IV, K2) o se si utilizza un rilevatore K3 con orientamento orizzontale (larghezza > altezza dell'immagine).
- Non modificare il Inside_Radius_Ang (90) e il Outside_Radius_Ang (3.0). La sottrazione reticolare viene eseguita tra due risoluzioni (l'unità è in angstrom).
- Pixel_Ang: specificare la dimensione dei pixel come valore a virgola mobile.
- Soglia: valore di soglia di sottrazione per sostituire il reticolo con lo sfondo nello spazio di Fourier. I valori utilizzati correttamente sono compresi tra 1,4 e 1,6. Usa 1.42 come punto di partenza.
- Non modificare expand_pixel (10) e pad_out_opt (0). expand_pixel è un valore di diametro utilizzato per mascherare intorno ai pixel con valori superiori al limite di soglia. pad_out_opt è un'opzione che decide se un'area riempita è inclusa nell'output.
- addpath_m: Percorso degli script di supporto.
- path_to_matlab_bin: Percorso della directory del bin di installazione di Matlab del sistema.
- path_matlab_script: Percorso dello script di sottrazione matlab (lsub.m ) che è stato copiato sopra nel passaggio 6.1.2.
- Input: percorso della directory che contiene le micrografie corrette per il movimento in formato mrc. Utilizzare una directory o un modello che includa caratteri jolly (?, *).
- Dopo aver salvato lo script modificato, eseguire lo script (bash ./process_subtraction.sh ) per sottrarre il segnale della streptavidina dalle micrografie di input. Lo script può essere interrotto e/o riavviato se il parametro only_do_unfinished è impostato su true (vedere al punto 6.2.3). Se si verifica un errore, esaminare i parametri specificati nello script bash. Assicurarsi che non vi siano spazi indesiderati tra le variabili di parametro e i valori assegnati, poiché questa è una fonte comune di errori.
- Utilizzare le immagini sottratte a reticolo per l'elaborazione standard delle immagini crio-EM.
Representative Results
Dopo l'evaporazione del carbonio nella fase 3.21 (di solito dopo una settimana), le griglie di affinità della streptavidina possono essere utilizzate per la preparazione di campioni crio-EM o di colorazione negativa seguendo le procedure descritte nelle fasi 4 e 5. Una micrografia rappresentativa catturata utilizzando un rivelatore K3 su un titano Krios a 81.000X di ingrandimento con una dimensione dei pixel di 1,05 Å di un campione biotinilato congelato con griglie di affinità streptavidina è mostrata nella Figura 4A. La corretta formazione del reticolo è osservata dal motivo a griglia continua che appare sullo sfondo dell'immagine. Questo può essere osservato più facilmente dal modello di diffrazione che appare nella trasformata di Fourier veloce (FFT) mostrata nella Figura 4A (a destra). Dopo la raccolta dei dati, seguendo la procedura descritta nella fase 6 di questo protocollo, il segnale che viene fornito all'immagine dal reticolo della streptavidina può essere mascherato computazionalmente per produrre una micrografia sottratta (Figura 4B) che può essere utilizzata per le successive fasi di elaborazione dei dati. La FFT nella Figura 4B (a destra) mostra che il modello di diffrazione osservato nella Figura 4A (a destra) è stato rimosso con successo dall'immagine originale.
La Figura 4C mostra un esempio di micrografia eseguita su un microscopio Tecnai 12 ad un ingrandimento di 49.000x con una dimensione dei pixel di 1,6 Å di un campione biotinilato legato a griglie di affinità streptavidina e colorato negativamente utilizzando formiato di uranile. Le griglie sono state preparate seguendo la procedura descritta nella fase 4 di questo protocollo, lasciando una pellicola di macchia più spessa.
Ci sono diverse osservazioni comuni quando la procedura di fabbricazione della griglia della streptavidina non ha successo che sono descritte ulteriormente nella sezione di discussione e nella Tabella 1. Figura 5 mostra diversi esempi di queste osservazioni. La Figura 5A mostra una micrografia di una griglia di affinità della streptavidina colorata negativamente utilizzata da un lotto prodotto con più di sei mesi di vita. Il monostrato si è mobilitato dai fori nella lamina di carbonio delle griglie quantifoil e si osserva con dimensioni simili ai fori nella griglia. La Figura 5B mostra un esempio di cristalli di streptavidina che hanno un'elevata mosaicità e che vengono facilmente perturbati durante le procedure di preparazione del campione. La Figura 5C mostra una micrografia rappresentativa di una griglia di affinità della streptavidina in cui l'evaporazione del carbonio nella fase 3.21 è troppo sottile o omessa. Il reticolo della streptavidina si è frammentato durante il processo di preparazione del campione crio-EM. La Figura 5D mostra una griglia di affinità della streptavidina colorata negativamente che presenta una contaminazione da vescicole lipidiche, probabilmente a causa di lavaggi insufficienti durante la fase 3.13 o del lato oro della griglia che si bagna durante le fasi 3.13-3.20. Si prega di fare riferimento alla sezione di discussione e alla Tabella 1 per le strategie per superare questi problemi comuni.
Figura 1: Schema della procedura di fabbricazione della griglia di affinità della streptavidina. (A) Cronologia generale della procedura di fabbricazione della griglia di affinità della streptavidina. L'intera procedura può essere completata nell'arco di due settimane, richiedendo due fasi di evaporazione del carbonio e una settimana dopo ciascuna per consentire al carbonio di invecchiare a sufficienza. (B) Ingrandito in vista di un quadrato della griglia di una griglia di affinità streptavidina che mostra gli strati che compongono la griglia dopo il completamento del processo di fabbricazione, tra cui la griglia crio-EM standard con barre d'oro e pellicola di carbonio forata, il primo strato di carbonio evaporato, il monostrato lipidico, il cristallo di streptavidina 2D e lo strato di supporto di carbonio evaporato sul retro. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Cristallizzazione del monostrato lipidico e della streptavidina (A) Immagini che dimostrano come formare con successo il monostrato lipidico all'interno della piccola capsula di Petri utilizzando il borotalco per creare un confine per l'olio di ricino che crea una pressione superficiale costante durante la formazione del monostrato lipidico. (B) Immagini che dimostrano come far crescere cristalli di streptavidina su griglie crio-EM. Innanzitutto, il lato carbonio delle griglie viene toccato con il monostrato lipidico e seguito da tre lavaggi consecutivi nel tampone di cristallizzazione. Viene aggiunta la streptavidina e le griglie vengono incubate in una camera di umidità per 2 ore. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Parametri di esempio per il file process_subtraction.cfg per l'esecuzione della sottrazione reticolare di streptavidina da micrografie (passaggio 6). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Risultati rappresentativi della fabbricazione di una griglia di affinità streptavidina di successo. (A) Micrografia crio-EM di complessi proteina/nucleosoma biotinilati preparati con griglie di affinità streptavidina fatte in casa. La FFT è mostrata a destra e mostra il modello di diffrazione dei cristalli di streptavidina. (B) La stessa micrografia del pannello A è mostrata seguendo la procedura di sottrazione reticolare per rimuovere il segnale dal cristallo di streptavidina 2D dall'immagine originale. (C) Un esempio di micrografia ottenuta dalla colorazione negativa di un campione biotinilato legato a griglie di affinità streptavidina. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Risultati rappresentativi della fabbricazione di reti di affinità streptavidina non riuscite. (A) Micrografia che mostra la mobilizzazione del monostrato di streptavidina dai fori della griglia quando le griglie sono più vecchie di sei mesi. (B) Micrografia che mostra reticoli di streptavidina con elevata mosaicità che vengono facilmente danneggiati durante le procedure di preparazione del campione sia crio-EM che con colorazione negativa. (C) Micrografia che mostra la frammentazione del reticolo di streptavidina durante la preparazione del campione crio-EM quando lo strato di evaporazione del carbonio nella fase 3.21 è troppo sottile o omesso. (D) Micrografia rappresentativa contaminata da vescicole lipidiche, probabilmente a causa di un lavaggio insufficiente durante la fase 3.13 o dell'umidità del lato oro della griglia durante le fasi 3.13-3.20. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: Guida alla risoluzione dei problemi per superare le sfide comunemente riscontrate durante la fabbricazione non riuscita della griglia di affinità streptavidina. Clicca qui per scaricare questa tabella.
File di codifica supplementare 1: lsub.m Fare clic qui per scaricare questo file.
File di codifica supplementare 2: process_subtration.sh Fare clic qui per scaricare questo file.
File di codifica supplementare 3: process_subtraction.cfg Fare clic qui per scaricare questo file.
File di codifica supplementare 4: bg_drill_hole.m Fare clic qui per scaricare questo file.
File di codifica supplementare 5: bg_FastSubtract_standard.m Fare clic qui per scaricare questo file.
File di codifica supplementare 6: bg_Pick_Amp_masked_standard.m Fare clic qui per scaricare questo file.
File di codifica supplementare 7: bg_push_by_rot.m Fare clic qui per scaricare questo file.
File di codifica supplementare 8: ReadMRC.m Fare clic qui per scaricare questo file.
File di codifica supplementare 9: WriteMRC.m Fare clic qui per scaricare questo file.
File di codifica supplementare 10: WriteMRCHeader.m Fare clic qui per scaricare questo file.
Discussion
Il nostro protocollo descrive come creare e utilizzare griglie di affinità della streptavidina e come elaborare i dati contenenti il segnale di diffrazione della streptavidina. Ci sono diversi passaggi critici nel protocollo che richiedono un'attenzione speciale.
I batch di griglia non riusciti possono essere ricondotti a diversi errori comuni. La fonte di errore più comune deriva dall'utilizzo di reagenti obsoleti o di scarsa qualità. È particolarmente importante preparare la soluzione lipidica biotinilata esattamente come descritto nel protocollo. Inoltre, eventuali impurità, come residui di detersivo sul materiale da laboratorio o oli naturalmente presenti sulla pelle, possono influire sulla qualità dei cristalli di streptavidina e, quindi, sulla qualità delle immagini risultanti. Si consiglia quindi di eseguire tre cicli di lavaggio delle griglie prima della prima evaporazione del carbonio per rimuovere l'eventuale contaminazione da tensioattivi dal produttore della griglia (fase 2.1). Inoltre, è stato osservato che la contaminazione o l'impurità dell'olio di ricino ostacola la formazione di cristalli sulla griglia.
Realizzare e raccogliere il monostrato lipidico è un'attività che dovrebbe essere praticata un paio di volte per avere un'idea dei piccoli volumi lipidici. Non è insolito che questo passaggio fallisca le prime due o tre volte prima che possa essere prodotto un monostrato lipidico adeguato, come si riflette in ultima analisi nella qualità dei cristalli di streptavidina che si vedono nelle griglie colorate negativamente (Figura 4C).
È importante non lasciare mai che la parte posteriore (lato oro, lato lipidico) della griglia si bagni durante il processo di fabbricazione della griglia (passaggi 3.12-3.20). Nel caso in cui la parte posteriore si bagni, si consiglia di scartare la griglia. Ciò può causare la comparsa di vescicole lipidiche di grandi dimensioni che interrompono la qualità dell'immagine (Figura 5D) (Riga 3, Tabella 1). Le vescicole lipidiche possono essere osservate anche a causa di un lavaggio insufficiente dopo l'applicazione del monostrato lipidico (passaggio 3.13). Si raccomandano tre lavaggi successivi con tampone di cristallizzazione dopo aver toccato il monostrato lipidico prima di aggiungere streptavidina.
Dopo che un sottile strato di carbonio è stato evaporato su griglie incorporate in trealosio, la parte posteriore della griglia può essere bagnata senza danneggiare la qualità del reticolo. Ad esempio, la bagnatura della parte posteriore si osserva spesso quando il tampone del campione contiene quantità anche minime di detersivo. La bagnatura della parte posteriore da parte del campione può provocare un legame non specifico dei campioni al sottile film di carbonio sul retro, il che riduce l'efficacia di impedire alle particelle di diffondersi all'interfaccia aria-acqua o l'uso del legame di affinità per le strategie di purificazione in griglia. Se possibile, aggiungere il campione alla griglia in assenza di detersivo. Il detersivo e altri additivi possono essere aggiunti successivamente durante le fasi di lavaggio della griglia o aggiunti in una fase finale prima della vetrificazione. Questa è una limitazione all'uso delle griglie di affinità della streptavidina; Tuttavia, se l'obiettivo è quello di migliorare l'orientamento preferenziale, la preparazione del campione con tamponi, compreso il detergente, è stata eseguita con successo11.
Una fonte comune di errore può essere ricondotta all'età delle griglie rispetto a entrambe le fasi di evaporazione del carbonio (fase 2.3 e fase 3.21). In questo protocollo, il periodo di attesa raccomandato è di 5-7 giorni dopo l'evaporazione del carbonio posteriore prima di utilizzare le griglie di streptavidina per la crio-EM. Quando le griglie vengono utilizzate troppo presto dopo la fabbricazione, è stato osservato che il reticolo e il monostrato lipidico si mobilizzano fuori dai fori della griglia. Un'osservazione simile può essere fatta quando le griglie sono troppo vecchie e utilizzate dopo sei mesi (Figura 5A) (Riga 1, Tabella 1). Ipotizziamo che questa osservazione sia spiegata da cambiamenti nell'idrofobicità del supporto di carbonio che viene applicato per stabilizzare il monostrato lipidico e i cristalli di streptavidina. Inoltre, i reticoli di streptavidina possono apparire a mosaico (Figura 5B) (Riga 3, Tabella 1) e rotti sia nella colorazione negativa che nella crio-EM se il monostrato viene applicato a griglie in cui il primo strato di evaporazione del carbonio (fase 2.3) non è sufficientemente invecchiato.
Un'ulteriore fonte comune di errore può essere ricondotta alla fragilità del monostrato cristallino della streptavidina (il monostrato lipidico è esso stesso fluido e può espandersi o comprimersi in modo reversibile). L'evaporazione del carbonio sul retro (fase 3.21) fornisce una stabilità critica sia al monostrato che al reticolo di streptavidina durante il processo di adsorbimento del campione, lavaggio e crio-EM blotting. In assenza di una sufficiente evaporazione del carbonio sul retro della griglia, i reticoli di streptavidina appariranno spesso frammentati dopo la tamponazione/congelamento (Figura 5C) (Riga 2, Tabella 1). In questo protocollo, suggeriamo l'uso di un congelatore a immersione automatizzato su un lato per il blotting su un lato. Questo metodo produce condizioni di blotting altamente riproducibili che preservano il reticolo di streptavidina durante il processo di congelamento e consentono un'ottimizzazione semplificata dell'applicazione del campione e dei parametri di blotting. In alternativa, sono stati utilizzati altri apparecchi di surgelazione automatica in combinazione con il tamponamento manuale. Per fare ciò, l'effettiva funzione di tamponamento è disabilitata nelle impostazioni del dispositivo e la griglia viene invece tamponata raggiungendo con un paio di pinzette che tengono la carta assorbente attraverso l'ingresso laterale. Questo metodo può ottenere risultati di alta qualità per i laboratori che non dispongono di un dispositivo di tamponamento e surgelazione su un solo lato; Tuttavia, la riproducibilità da rete a rete è impegnativa.
Sebbene l'utilizzo delle griglie di affinità della streptavidina abbia molti vantaggi, è necessario prendere in considerazione alcune limitazioni di questo metodo. A causa della natura della procedura, di solito non è possibile valutare la qualità del reticolo di streptavidina fino a quando l'intero processo non è stato completato. Si consiglia di selezionare rapidamente la qualità di ciascun lotto in base alla colorazione negativa prima di congelare i campioni. A causa del segnale fornito dal reticolo della streptavidina alle immagini grezze, può essere difficile in alcuni casi valutare, dalle sole immagini, se c'è un numero sufficiente di particelle intatte e disperse. Per lo stesso motivo, l'elaborazione al volo dei dati crio-EM durante l'acquisizione dei dati non è possibile a meno che la procedura di sottrazione del segnale della streptavidina non sia stata inclusa nella pipeline di pre-elaborazione dei dati. Poiché il segnale della streptavidina viene solitamente sottratto dalle immagini corrette per il movimento e non dai fotogrammi stessi, la lucidatura bayesiana, implementata nelle suite software più diffuse, potrebbe non riuscire quando si utilizzano le procedure di sottrazione descritte. Si raccomanda quindi di eseguire la correzione del movimento in più patch per ridurre al minimo il movimento delle particelle dall'inizio dell'elaborazione dei dati16.
Nonostante queste limitazioni, le griglie di affinità della streptavidina offrono molti vantaggi. Due dei principali vantaggi che le griglie di affinità della streptavidina offrono rispetto alle griglie crio-EM standard a foro aperto sono un mezzo per proteggere i campioni dall'interfaccia aria-acqua e concentrare i campioni di bassa abbondanza (10-100 nM) sulla griglia. Anche altri strati di supporto, come l'ossido di carbonio e l'ossido di grafene, possono essere utilizzati come strategie per superare questi colli di bottiglia nella preparazione dei campioni. In un esempio, le griglie di affinità della streptavidina erano l'unica soluzione per ottenere una ricostruzione intatta di un'interazione proteina-acido nucleico che era incompatibile con gli approcci di cross-linking. 12
Un altro grande vantaggio fornito dalle griglie di affinità della streptavidina è una soluzione per i campioni che si adsormono ad altri strati di supporto, come l'ossido di carbonio o di grafene, con orientamenti preferenziali che ostacolano la capacità di ottenere una ricostruzione 3D del campione di interesse. La biotinilazione casuale dei campioni utilizzando kit disponibili in commercio consente l'attacco casuale del campione di interesse al monostrato di streptavidina per ottenere più viste potenziali per superare questa sfida.
Inoltre, le griglie di affinità della streptavidina offrono vantaggi unici rispetto alle griglie basate sull'affinità. L'elevata affinità e specificità dell'interazione streptavidina-biotina consente l'accoppiamento delle griglie di affinità della streptavidina con altri flussi di lavoro che coinvolgono la biotina per purificare i complessi di interesse. In un esempio pubblicato, gli autori hanno immobilizzato un complesso sulle griglie di affinità della streptavidina e hanno incubato un partner di legame di stechiometria sconosciuta in grande eccesso. Dopo aver lavato via qualsiasi proteina non legata, il supercomplesso correttamente assemblato è stato ottenuto e ha potuto essere immediatamente analizzato con cryo-EM11. Una possibile applicazione futura potrebbe essere quella di combinare i tag proteici leganti la streptavidina, il sistema Avi-tag o gli approcci di marcatura di prossimità con le griglie di affinità della streptavidina per estrarre singole proteine e/o complessi proteici direttamente da fonti ricombinanti o endogene senza schemi di purificazione elaborati standard.
Fornendo questo protocollo, i laboratori dovrebbero essere in grado di riprodurre facilmente la fabbricazione di griglie di affinità della streptavidina e stabilirle come uno strumento più comunemente usato per l'analisi strutturale di complessi proteici mediante crio-EM.
Disclosures
Nessuno.
Acknowledgments
T.C. è stato supportato dal National Institute of General Medical Sciences borsa di studio per la formazione in biofisica molecolare GM-08295 e dalla borsa di studio per la ricerca universitaria della National Science Foundation con numero di sovvenzione DGE 2146752. R.G. e B.H. sono stati sostenuti dalla sovvenzione R21-GM135666 del National Institute of Health assegnata a R.G. e B.H. Questo lavoro è stato parzialmente finanziato attraverso la sovvenzione R35-GM127018 del National Institute of General Medical Sciences assegnata a E.N. E.N. è un ricercatore dell'Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine-N-(biotinyl) sodium salt | Avanti Polar Lipids | 870285P | Comes as a powder. Dissolve at concentration of 1–10 mg/mL in chloroform/methanol/water solvent, 65:35:8 v/v and store in single use aliquots at -80 °C |
| 200 proof pure ethanol | Fisher Scientific | 07-678-005 | |
| 5 μL Hamilton Syringe | Hamilton | 87930 | 5 µL Microliter Syringe Model 75 RN, Small Removable Needle, 26 G, 2 in, point style 2 |
| Castor Oil | Sigma Adrich | 259853 | |
| Cell culture dishes untreated (35 mm) | Bio Basic | SP22146 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 650471 | |
| D-(+)-Trehalose dihydrate,from starch, ≥99% | Sigma Aldrich | T9449 | |
| DUMONT Anti-Capillary Reverse (self-closing) Tweezers Biology Grade | Ted Pella | 510-5NM | |
| HPLC Grade Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | |
| Leica EM ACE600 High Vacuum Sputter Coater | Leica | ||
| Leica EM GP2 Automatic Plunge Freezer | Leica | ||
| Quantifoil R 2/1 Au300 | Quantifoil | Q84994 | |
| Steptavidin | New England Bioscience | N7021S | Comes as 1 mg/mL solution. Dilute to final concentration of 0.5 mg /mL in crystallization bufferwith a final trehalose concentration of 10%. Can be flash frozen in 25–50 μL aliquots |
| Talcum powder | Carolina | 896060 | |
| Whatman Grade 1 filter paper | Cytiva | 1001-085 |
References
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