Generierung und Downstream-Analyse von Einzelzell- und Einzelkern-Transkriptomen in Hirnorganoiden
Summary
Hier stellen wir ein umfassendes Protokoll für die Generierung und nachgelagerte Analyse von menschlichen Gehirnorganoiden mittels Einzelzell- und Einzelkern-RNA-Sequenzierung vor.
Abstract
In den letzten zehn Jahren hat sich die Einzelzell-Transkriptomik erheblich weiterentwickelt und ist zu einer Standardlabormethode für die gleichzeitige Analyse von Genexpressionsprofilen einzelner Zellen geworden, die die Erfassung der zellulären Vielfalt ermöglicht. Um die Einschränkungen durch schwer zu isolierende Zelltypen zu überwinden, kann für die Sequenzierung ein alternativer Ansatz verwendet werden, der darauf abzielt, einzelne Zellkerne anstelle von intakten Zellen zu gewinnen, wodurch das Transkriptom-Profiling einzelner Zellen universell anwendbar wird. Diese Techniken sind zu einem Eckpfeiler in der Erforschung von Gehirnorganoiden geworden und haben sie als Modelle des sich entwickelnden menschlichen Gehirns etabliert. Dieses Protokoll nutzt das Potenzial der Einzelzell- und Einzelkern-Transkriptomik in der Hirn-Organoidforschung und stellt eine Schritt-für-Schritt-Anleitung dar, die wichtige Verfahren wie Organoid-Dissoziation, Einzelzell- oder Zellkernisolierung, Bibliotheksvorbereitung und Sequenzierung umfasst. Durch die Implementierung dieser alternativen Ansätze können Forscher qualitativ hochwertige Datensätze erhalten, die die Identifizierung neuronaler und nicht-neuronaler Zelltypen, Genexpressionsprofile und Zelllinienverläufe ermöglichen. Dies ermöglicht umfassende Untersuchungen zellulärer Prozesse und molekularer Mechanismen, die die Entwicklung des Gehirns prägen.
Introduction
In den letzten Jahren haben sich Organoidtechnologien als vielversprechendes Werkzeug für die Kultivierung organähnlicher Gewebe erwiesen 1,2,3. Gerade für Organe, die nicht leicht zugänglich sind, wie z.B. das menschliche Gehirn, bieten Organoide die Möglichkeit, Einblicke in die Entstehung und Krankheitsmanifestation zu gewinnen4. Daher wurden Gehirnorganoide häufig als experimentelles Modell zur Untersuchung verschiedener Erkrankungen des menschlichen Gehirns verwendet, einschließlich Entwicklungs-, psychiatrischer oder sogar neurodegenerativer Erkrankungen 4,5,6.
Mit dem Aufkommen von Einzelzell-Transkriptom-Profiling-Technologien konnten primäre menschliche Gewebe und komplexe In-vitro-Modelle mit einer noch nie dagewesenen Granularität untersucht werden, was mechanistische Einblicke in Genexpressionsänderungen auf der Ebene von Zellsubpopulationen bei Gesundheit und Krankheit lieferte und über neue mögliche therapeutische Ziele informierte 7,8,9. Das Organoid-Feld hat sich weiterentwickelt, indem Einzelzell-Transkriptom-Profiling verwendet wurde, um die zelluläre Zusammensetzung, Reproduzierbarkeit und die Genauigkeit von Organoid-Technologien im Gehirn zu beurteilen 10,11,12. Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) ermöglichte die Zellklassifikation und die Identifizierung genetischer Dysregulation in erkrankten Organoiden13,14. Wichtig ist, dass die Komplexität von organoiden Geweben die Implementierung von Techniken erfordert, die die Profilerstellung einzelner Zellen ermöglichen. Die Charakterisierung von Organoiden mit Methoden wie dem Bulk Transcriptome Profiling (Bulk RNA Sequencing) führt zu maskierten zellulären Heterogenitäts- und Genexpressionsprofilen, die über alle Zelltypen innerhalb des komplexen Gewebes gemittelt werden, was letztendlich unser Verständnis der ablaufenden Prozesse während der Organoidentwicklung in Gesundheit und Krankheit einschränkt 15,16,17 . Mit der Weiterentwicklung der scRNA-seq-Methoden wird eine zunehmende Anzahl von Atlanten erstellt, wie z. B. der Allen Brain Atlas oder der Single cell atlas of human brain organoids von Uzquiano et al.18.
Die erfolgreiche Durchführung von scRNA-seq aus Gehirnorganoiden hängt von der effektiven Isolierung und dem Einfangen intakter Zellen ab. Da die Dissoziation von Gehirnorganoiden zur Gewinnung einzelner Zellen auf enzymatischer Verdauung basiert, kann sie die Genexpressionsmuster beeinflussen, indem sie Stress und Zellschäden induziert19,20. Daher ist die Dissoziation des Gewebes in einzelne Zellen der wichtigste Schritt. Ein alternativer Ansatz ist die Einzelkern-RNA-Sequenzierung (snRNA-seq), die die enzymfreie Extraktion von Zellkernen sowohl aus frischem als auch aus gefrorenem Gewebe ermöglicht21,22. Die Isolierung von Zellkernen aus einem Gewebe bringt jedoch weitere Herausforderungen mit sich, wie z. B. die Anreicherung von Zelltypen von Interesse und den geringen RNA-Gehalt von Zellkernen im Vergleich zu Zellen.
Transkriptomstudien an Gehirnorganoiden werden häufig mit scRNA-seq 10,18,23 durchgeführt. Die Isolierung einzelner Kerne könnte jedoch eine orthogonale und ergänzende Methode zur Untersuchung des transkriptomischen Profils von Organoiden darstellen. Hier stellen wir eine Toolbox für scRNA- und snRNA-seq für Hirnorganoide vor und diskutieren die kritischen Punkte, um die besten Sequenzierungsdaten zu erhalten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die transkriptomische Analyse einzelner Zellen und einzelner Zellkerne hat sich zu einem zentralen Werkzeug für das Verständnis der genregulatorischen Mechanismen in komplexen Geweben entwickelt. Beide Methoden ermöglichen Transkriptom-Untersuchungen von Hirnorganoiden. Um einen insgesamt erfolgreichen Versuch zu gewährleisten, ist die Qualität des Ausgangsmaterials von hoher Relevanz. Daher ist es notwendig, die Organoide regelmäßig zu schneiden, um die Bildung eines nekrotischen Kernszu verhind…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Valeria Fernandez-Vallone für die Originalanleitung für das Miltenyi Neural Dissociation Kit. Wir danken auch der Genomics Technology Platform des Max Delbrück Centrums für die Bereitstellung des Rezepts für den NP40-Lysepuffer und die wertvolle Beratung bei der Einrichtung dieses Protokolls. Wir danken auch Margareta Herzog und Alexandra Tschernycheff für die organisatorische Unterstützung des Labors.
Materials
| 1,4-DITHIO-DL-THREIT-LSG., F. D. MOL.-BIOL., ~1 M IN H2O (DTT) | Sigma | 43816-10ML | |
| 1.5 ml DNA low binding tubes | VWR | 525-0130 | microcentrifuge tube |
| 10x Cellranger pipeline | analysis pipline | ||
| 15 ml Falcon | Falcon | Centrifuge tube | |
| 2-Mercaptoethanol (BME) | Life Technologies | 21985023 | |
| 50 ml Falcon | Falcon | Centrifuge tube | |
| A83-01 | Bio Technologies | 379762 | |
| Antibiotic/Antimycotic Solution (100X) | Life Technologies | 15240062 | |
| B-27 Plus Supplement | Life Technologies | 17504044 | |
| B-27 Supplement without vitamin A | Life Technologies | 12587010 | |
| Bovine serum albumin, fatty acid free (BSA) | Sigma Aldrich | A8806-5G | |
| cAMP | Biogems | 6099240 | |
| cAMP | Biogems | 6099240 | |
| C-CHIP NEUBAUER IMPROVED | VWR | DHC-N01 | |
| Cell strainer 40 µm | Neolab | 352340 | |
| Cell strainer 70 µm (white) Nylon | Sigma | CLS431751-50EA | |
| Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit | 10X Genomics | 1000204 | |
| Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit, 16 rxns | 10X Genomics | 1000127 | |
| Chromium Next GEM Single Cell 3' Kit v3.1 | 10X Genomics | 1000268 | |
| Complete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktaill | Roche | 11873580001 | |
| DAPI | MERCK Chemicals | 0000001722 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11320074 | |
| Dounce tissue grinder set 2 mL complete | Sigma Aldrich | 10536355 | |
| Essential E8 Flex Medium | Life Technologies | A2858501 | |
| EVE Cell Counting Slides | VWR | EVS-050 ( 734-2676) | |
| Foetal bovine serum tetracycline free (FBS) | PAN Biotech | P30-3602 | |
| Geltrex LDEV-Free (coating) | Life Technologies | A1413302 | |
| gentleMACS | Miltenyi Biotec | dissociation maschine | |
| GlutaMAX supplements | Life Technologies | 35050038 | |
| Heparin sodium cell culture tested | Sigma | H3149-10KU | |
| human recombinant BDNF | StemCell Technologies | 78005.3 | |
| human recombinant GDNF | StemCell Technologies | 78058.3 | |
| Insulin Solution Human | Sigma Aldrich | I2643-25MG | |
| Knockout serum replacement | Life Technologies | 10828028 | |
| LDN193189 Hydrochloride 98% | Sigma Aldrich | 130-106-540 | |
| MEM non-essential amino acid (100x) | Sigma Aldrich | M7145-100ml | |
| MgCl2 Magnesium Chloride (1M) RNAse free | Thermo Scientific | AM9530G | |
| mTeSR Plus | StemCell Technologies | 100-0276 | stem cell medium |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 85850 | stem cell medium |
| N2 Supplement | StemCell Technologies | 17502048 | |
| Neural Tissue Dissociation Kit | Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG | 130-092-628 | |
| Neurobasal Plus | Life Technologies | A3582901 | |
| NextSeq500 system | Illumina | Sequencer | |
| NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution | Life Technologies | 28324 | |
| PBS Dulbecco’s | Invitrogen | 14190169 | |
| PenStrep (Penicillin – Streptomycin) | Life Technologies | 15140122 | |
| Percoll | Th. Geyer | 10668276 | |
| Pluronic (R) F-127 | Sigma Aldrich | P2443-1KG | |
| RiboLock RNase Inhibitor | Life Technologies | EO0382 | |
| Rock Inhibitor (Y-27632 dihydrochloride) SB | Biomol | Cay10005583-10 | |
| SB 431542 | Biogems | 3014193 | |
| Sodium chloride NaCl (5M), RNase-free-100 mL | Invitrogen | AM9760G | |
| StemFlex Medium | Thermo Scientific | A3349401 | stem cell medium |
| StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyi Biotec | 130-104-368 | stem cell medium |
| TC-Platte 96 Well, round bottom | Sarstedt | 83.3925.500 | |
| TISSUi006-A | TissUse GmbH | https://hpscreg.eu/cell-line/TISSUi006-A | |
| Trypan Blue | T8154-20ml | Sigma | |
| TrypLE Express Enzyme, no phenol red | Life Technologies | 12604013 | Trypsin-based reagent |
| UltraPure 1M Tris-HCl Buffer, pH 7.5 | Life Technologies | 15567027 | |
| XAV939 | Enzo Life sciences | BML-WN100-0005 |
Referências
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