B형 간염 바이러스 DNA의 실시간 중합효소 연쇄 반응 기반 검출 및 정량
Summary
B형 간염 바이러스(HBV) DNA의 실시간 중합효소연쇄반응(PCR) 기반 검출 및 정량화는 B형 간염 바이러스 감염을 진단하고 모니터링하기 위한 민감하고 정확한 방법입니다. 여기에서는 HBV DNA 검출 및 샘플의 바이러스 부하 측정을 위한 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
B형 간염 바이러스(HBV)는 전 세계적으로 간 질환의 중요한 원인입니다. 급성 또는 만성 감염으로 이어질 수 있어 치명적인 간경변과 간암에 매우 취약합니다. 혈액 내 HBV DNA의 정확한 검출 및 정량화는 HBV 감염을 진단하고 모니터링하는 데 필수적입니다. HBV DNA를 검출하는 가장 일반적인 방법은 Real-Time PCR로, 바이러스를 검출하고 바이러스 부하를 평가하여 항바이러스 요법에 대한 반응을 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다. 여기서는 IVD 마킹 Real-Time PCR 기반 키트를 사용하여 인간 혈청 또는 혈장에서 HBV DNA를 검출하고 정량화하기 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 이 키트는 HBV 게놈의 고도로 보존된 핵심 영역을 표적으로 하는 프라이머와 프로브를 사용하며 모든 HBV 유전자형(A, B, C, D, E, F, G, H, I 및 J)을 정확하게 정량화할 수 있습니다. 이 키트에는 가능한 PCR 억제를 모니터링하기 위한 내인성 내부 대조군도 포함되어 있습니다. 이 분석은 40 사이클 동안 실행되며 컷오프는 38 Ct입니다. 임상 샘플에서 HBV DNA의 정량을 위해 5가지 정량 표준물질 세트가 키트와 함께 제공됩니다. 이 표준물질에는 핵산 검사를 위한 HBV DNA에 대한 4번째 WHO 국제 표준(NIBSC 코드 10/266)에 따라 보정된 HBV 특이적 DNA의 알려진 농도가 포함되어 있습니다. 이 표준물질은 HBV 특이적 DNA 증폭의 기능을 검증하고 표준 곡선을 생성하는 데 사용되며, 이를 통해 샘플에서 HBV DNA를 정량화할 수 있습니다. PCR 키트를 사용하여 2.5IU/mL의 낮은 HBV DNA를 검출했습니다. 이 키트의 높은 감도와 재현성은 임상 실험실에서 강력한 도구가 되어 의료 전문가가 HBV 감염을 효과적으로 진단하고 관리하는 데 도움이 됩니다.
Introduction
B형 간염 바이러스(HBV)는 오르토헤파드나바이러스(Orthohepadnavirus) 속과 헤파드나비리과(Hepadnaviridae family)1에 속하는 부분 이중 가닥 DNA 바이러스입니다. 이는 평생 지속되는 만성 감염을 유발할 수 있으며, 간경변증과 간세포암으로 이어질 수 있다 2,3,4. 세계보건기구(WHO)에 따르면 2019년 약 2억 9,600만 명의 인구가 만성 B형 간염 감염을 앓고 있었으며 매년 150만 명이 새로 감염되었습니다5.
혈청 또는 혈장 샘플에서 HBV DNA의 식별 및 측정은 진행 중인 B형 간염 감염자를 검출하고, 항바이러스 치료의 효능을 평가하고, 치료 성공 확률을 예측하는 데 유용한 방법입니다 6,7,8,9,10,11. 높은 바이러스 양은 간경변 및 간암을 포함한 간 질환 진행 위험 증가와 관련이 있습니다12,13. 따라서 바이러스 양을 정확하게 측정하는 것은 HBV 감염의 진행을 추적하고 치료에 관한 결정을 내리는 데 매우 중요합니다.
정량적 Real-Time PCR 분석은 기존 PCR 기술보다 더 높은 감도, 더 넓은 동적 범위 및 HBV DNA의 더 정확한 정량을 제공합니다 14,15,16,17. 혈청 또는 혈장 샘플에서 HBV DNA를 정량화하기 위한 여러 상용 Real-Time PCR 기반 분자 진단 키트가 시중에 나와 있습니다. 여기에서는 시판되는 IVD 표시 Real-Time PCR 기반 키트를 사용하여 인간 혈청 또는 혈장에서 HBV DNA를 검출하고 정량화하기 위한 자세한 워크플로우를 설명합니다. 이 키트는 널리 사용되는18,19, 저비용이지만 고감도 분석법이며, 그 성능 특성은 상업적으로 이용 가능한 다른 CE 마크 키트(들)18와 비슷합니다. HBV 표적 부위 증폭 외에도 내인성 내부 대조 유전자도 키트에 포함되어 샘플의 품질, 추출된 DNA의 품질, PCR 증폭 및 가능한 PCR 억제를 검증합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
NIBSC 코드 10/266은 공급업체 정보21에 따라 0.5mL의 뉴클레아제가 없는 물에서 재구성할 때 9,55,000IU/mL의 단위가 할당되었습니다. 이것은 고부하 HBV 양성 샘플로 간주될 수 있습니다. 이 연구에 사용된 바이러스 부하 키트로 측정된 HBV 바이러스 양은 6,65,900IU/mL였습니다(그림 4). DNA 추출 키트의 DNA 추출 효율이 100%가 아니기 때문에 정제 과정에서 일부 DNA가 손실?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
기술 지원을 해주신 Praveen, Kusum, Chandan, Isha, Rashmi, Babli, Shivani, Ankita 및 Shikha에게 감사드립니다.
Materials
| 4th WHO International Standard for hepatitis B virus DNA | NIBSC | NIBSC code: 10/266 | The 4th WHO International Standard for hepatitis B virus (HBV) DNA, NIBSC code 10/266, is intended to be used for the calibration of secondary reference reagents used in HBV nucleic acid amplification techniques (NAT). |
| ABI real-time PCR machines | ThermoFisher Scientific | ABI 7500; QuantStudio 5 | This is a real time PCR machine |
| HBV, HCV and HIV Multiplex 14/198 | NIBSC | NIBSC code: 14/198 | This is a very low positive triplex reagent for NAT assays containing hepatitis B (HBV), hepatitis C (HCV) and human immunodeficiency virus-1 (HIV-1) |
| QIAGEN real-time PCR machine | Qiagen | Rotor-Gene Q | This is a real time PCR machine |
| TRUPCR HBV Viral Load kit | Kilpest India Limited | 3B294 | This is a real time PCR based kit used in this study for the HBV DNA detection and viral load determination |
| TRUPCR Viral Nucleic Acid Extraction Kit | Kilpest India Limited | 3B214 | This is a DNA extraction kit used for the extraction of HBV viral DNA from NIBSC:10/266 and NIBSC:14/198 |
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