يعد الكشف عن الحمض النووي لفيروس التهاب الكبد B (HBV) القائم على تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وتحديده الكمي في الوقت الفعلي طريقة حساسة ودقيقة لتشخيص عدوى فيروس التهاب الكبد B ورصدها. هنا ، نقدم بروتوكولا للكشف عن الحمض النووي لفيروس التهاب الكبد B وقياس الحمل الفيروسي للعينة.
فيروس التهاب الكبد B (HBV) هو سبب مهم لأمراض الكبد في جميع أنحاء العالم. يمكن أن يؤدي إلى التهابات حادة أو مزمنة ، مما يجعل الأفراد عرضة للإصابة بتليف الكبد القاتل وسرطان الكبد. يعد الكشف الدقيق عن الحمض النووي لفيروس التهاب الكبد B في الدم وقياسه أمرا ضروريا لتشخيص ومراقبة عدوى فيروس التهاب الكبد الوبائي. الطريقة الأكثر شيوعا للكشف عن الحمض النووي لفيروس التهاب الكبد B هي تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي ، والذي يمكن استخدامه للكشف عن الفيروس وتقييم الحمل الفيروسي لمراقبة الاستجابة للعلاج المضاد للفيروسات. هنا ، نصف بروتوكولا مفصلا للكشف عن الحمض النووي لفيروس التهاب الكبد B وقياسه في المصل البشري أو البلازما باستخدام مجموعة تستند إلى تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي تحمل علامة IVD. تستخدم المجموعة البادئات والمجسات التي تستهدف المنطقة الأساسية المحفوظة للغاية لجينوم HBV ويمكنها تحديد جميع الأنماط الجينية HBV بدقة (A ، B ، C ، D ، E ، F ، G ، H ، I ، و J). تتضمن المجموعة أيضا تحكما داخليا داخليا لمراقبة تثبيط تفاعل البوليميراز المتسلسل المحتمل. يعمل هذا الفحص لمدة 40 دورة ، وقطعه هو 38 قيراطا. لتحديد كمية الحمض النووي لفيروس التهاب الكبد B في العينات السريرية ، يتم توفير مجموعة من 5 معايير قياس كمي مع المجموعة. تحتوي المعايير على تركيزات معروفة من الحمض النووي الخاص بفيروس التهاب الكبد B والتي تمت معايرتها وفقا لمعيارمنظمة الصحة العالمية الدولي الرابع للحمض النووي لفيروس التهاب الكبد B لاختبار الحمض النووي (رمز NIBSC 10/266). تستخدم المعايير للتحقق من صحة وظائف تضخيم الحمض النووي الخاص بفيروس التهاب الكبد B ولإنشاء منحنى قياسي ، مما يسمح بالقياس الكمي للحمض النووي لفيروس التهاب الكبد B في العينة. تم الكشف عن الحمض النووي HBV منخفض يصل إلى 2.5 وحدة دولية / مل باستخدام مجموعة PCR. إن الحساسية العالية وقابلية التكرار للمجموعة تجعلها أداة قوية في المختبرات السريرية ، مما يساعد المتخصصين في الرعاية الصحية في تشخيص عدوى فيروس التهاب الكبد B وإدارتها بشكل فعال.
فيروس التهاب الكبد B (HBV) هو فيروس DNA مزدوج تقطعت به السبل جزئيا من جنس Orthohepadnavirus وعائلة Hepadnaviridae 1. يمكن أن يؤدي إلى عدوى مزمنة تستمر طوال حياة المرء ، مما قد يؤدي إلى تليف الكبد وسرطان الخلايا الكبدية2،3،4. وفقا لمنظمة الصحة العالمية (WHO) ، كان ما يقدر بنحو 296 مليون شخص يعيشون مع عدوى التهاب الكبد B المزمن في عام 2019 ، وأصيب 1.5 مليون شخص حديثا كلعام 5.
يعد تحديد وقياس الحمض النووي لفيروس التهاب الكبد B في عينات المصل أو البلازما بمثابة طريقة قيمة للكشف عن الأفراد المصابين بعدوى التهاب الكبد B المستمرة ، وتقييم فعالية العلاج المضاد للفيروسات ، والتنبؤ باحتمال نجاح العلاج6،7،8،9،10،11. يرتبط الحمل الفيروسي المرتفع بزيادة خطر الإصابة بأمراض الكبد ، بما في ذلك تليف الكبد وسرطان الكبد12,13. وبالتالي ، فإن القياس الدقيق للحمل الفيروسي أمر بالغ الأهمية لتتبع تطور عدوى فيروس التهاب الكبد B وإبلاغ القرارات المتعلقة بالعلاج.
تتميز فحوصات تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمية في الوقت الفعلي بحساسية أعلى ونطاق ديناميكي أوسع وتقدير كمي أكثر دقة للحمض النووي لفيروس التهاب الكبد B مقارنة بتقنيات تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدية14،15،16،17. تتوفر في السوق العديد من مجموعات التشخيص الجزيئي التجارية القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي لتحديد كمية الحمض النووي لفيروس التهاب الكبد B في عينات المصل أو البلازما. هنا ، نصف سير عمل مفصل للكشف عن الحمض النووي لفيروس التهاب الكبد B وقياسه في المصل البشري أو البلازما باستخدام مجموعة PCR في الوقت الفعلي المتاحة تجاريا والتي تحمل علامة IVD. المجموعة عبارة عناختبار 18,19 مستخدم على نطاق واسع ، منخفض التكلفة ، ولكنه حساس للغاية ، وخصائص أدائه قابلة للمقارنة مع مجموعة (مجموعات) أخرى تحمل علامة CE المتاحة تجاريا 18. بصرف النظر عن تضخيم المنطقة المستهدفة لفيروس التهاب الكبد B ، يتم أيضا تضمين جين تحكم داخلي داخلي في المجموعة للتحقق من جودة العينات وجودة الحمض النووي المستخرج وتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل وتثبيط تفاعل البوليميراز المتسلسل المحتمل.
تم تعيين رمز NIBSC 10/266 لوحدة 9،55،000 وحدة دولية / مل عند إعادة تكوينها في 0.5 مل من الماء الخالي من النيوكلياز وفقا لمعلومات المورد21. يمكن اعتبار هذا عينة إيجابية عالية الحمل HBV. كان الحمل الفيروسي HBV الذي حددته مجموعة الحمل الفيروسي المستخدمة في هذه الدراسة 6،65،900 وحدة دولية / مل (<strong …
The authors have nothing to disclose.
نحن نعرب عن تقديرنا لبرافين وكوسوم وشاندان وإيشا وراشمي وبابلي وشيفاني وأنكيتا وشيخة لمساعدتهم الفنية.
4th WHO International Standard for hepatitis B virus DNA | NIBSC | NIBSC code: 10/266 | The 4th WHO International Standard for hepatitis B virus (HBV) DNA, NIBSC code 10/266, is intended to be used for the calibration of secondary reference reagents used in HBV nucleic acid amplification techniques (NAT). |
ABI real-time PCR machines | ThermoFisher Scientific | ABI 7500; QuantStudio 5 | This is a real time PCR machine |
HBV, HCV and HIV Multiplex 14/198 | NIBSC | NIBSC code: 14/198 | This is a very low positive triplex reagent for NAT assays containing hepatitis B (HBV), hepatitis C (HCV) and human immunodeficiency virus-1 (HIV-1) |
QIAGEN real-time PCR machine | Qiagen | Rotor-Gene Q | This is a real time PCR machine |
TRUPCR HBV Viral Load kit | Kilpest India Limited | 3B294 | This is a real time PCR based kit used in this study for the HBV DNA detection and viral load determination |
TRUPCR Viral Nucleic Acid Extraction Kit | Kilpest India Limited | 3B214 | This is a DNA extraction kit used for the extraction of HBV viral DNA from NIBSC:10/266 and NIBSC:14/198 |