الكشف القائم على تفاعل البلمرة المتسلسل في الوقت الحقيقي والقياس الكمي للحمض النووي لفيروس التهاب الكبد B
Summary
يعد الكشف عن الحمض النووي لفيروس التهاب الكبد B (HBV) القائم على تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وتحديده الكمي في الوقت الفعلي طريقة حساسة ودقيقة لتشخيص عدوى فيروس التهاب الكبد B ورصدها. هنا ، نقدم بروتوكولا للكشف عن الحمض النووي لفيروس التهاب الكبد B وقياس الحمل الفيروسي للعينة.
Abstract
فيروس التهاب الكبد B (HBV) هو سبب مهم لأمراض الكبد في جميع أنحاء العالم. يمكن أن يؤدي إلى التهابات حادة أو مزمنة ، مما يجعل الأفراد عرضة للإصابة بتليف الكبد القاتل وسرطان الكبد. يعد الكشف الدقيق عن الحمض النووي لفيروس التهاب الكبد B في الدم وقياسه أمرا ضروريا لتشخيص ومراقبة عدوى فيروس التهاب الكبد الوبائي. الطريقة الأكثر شيوعا للكشف عن الحمض النووي لفيروس التهاب الكبد B هي تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي ، والذي يمكن استخدامه للكشف عن الفيروس وتقييم الحمل الفيروسي لمراقبة الاستجابة للعلاج المضاد للفيروسات. هنا ، نصف بروتوكولا مفصلا للكشف عن الحمض النووي لفيروس التهاب الكبد B وقياسه في المصل البشري أو البلازما باستخدام مجموعة تستند إلى تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي تحمل علامة IVD. تستخدم المجموعة البادئات والمجسات التي تستهدف المنطقة الأساسية المحفوظة للغاية لجينوم HBV ويمكنها تحديد جميع الأنماط الجينية HBV بدقة (A ، B ، C ، D ، E ، F ، G ، H ، I ، و J). تتضمن المجموعة أيضا تحكما داخليا داخليا لمراقبة تثبيط تفاعل البوليميراز المتسلسل المحتمل. يعمل هذا الفحص لمدة 40 دورة ، وقطعه هو 38 قيراطا. لتحديد كمية الحمض النووي لفيروس التهاب الكبد B في العينات السريرية ، يتم توفير مجموعة من 5 معايير قياس كمي مع المجموعة. تحتوي المعايير على تركيزات معروفة من الحمض النووي الخاص بفيروس التهاب الكبد B والتي تمت معايرتها وفقا لمعيارمنظمة الصحة العالمية الدولي الرابع للحمض النووي لفيروس التهاب الكبد B لاختبار الحمض النووي (رمز NIBSC 10/266). تستخدم المعايير للتحقق من صحة وظائف تضخيم الحمض النووي الخاص بفيروس التهاب الكبد B ولإنشاء منحنى قياسي ، مما يسمح بالقياس الكمي للحمض النووي لفيروس التهاب الكبد B في العينة. تم الكشف عن الحمض النووي HBV منخفض يصل إلى 2.5 وحدة دولية / مل باستخدام مجموعة PCR. إن الحساسية العالية وقابلية التكرار للمجموعة تجعلها أداة قوية في المختبرات السريرية ، مما يساعد المتخصصين في الرعاية الصحية في تشخيص عدوى فيروس التهاب الكبد B وإدارتها بشكل فعال.
Introduction
فيروس التهاب الكبد B (HBV) هو فيروس DNA مزدوج تقطعت به السبل جزئيا من جنس Orthohepadnavirus وعائلة Hepadnaviridae 1. يمكن أن يؤدي إلى عدوى مزمنة تستمر طوال حياة المرء ، مما قد يؤدي إلى تليف الكبد وسرطان الخلايا الكبدية2،3،4. وفقا لمنظمة الصحة العالمية (WHO) ، كان ما يقدر بنحو 296 مليون شخص يعيشون مع عدوى التهاب الكبد B المزمن في عام 2019 ، وأصيب 1.5 مليون شخص حديثا كلعام 5.
يعد تحديد وقياس الحمض النووي لفيروس التهاب الكبد B في عينات المصل أو البلازما بمثابة طريقة قيمة للكشف عن الأفراد المصابين بعدوى التهاب الكبد B المستمرة ، وتقييم فعالية العلاج المضاد للفيروسات ، والتنبؤ باحتمال نجاح العلاج6،7،8،9،10،11. يرتبط الحمل الفيروسي المرتفع بزيادة خطر الإصابة بأمراض الكبد ، بما في ذلك تليف الكبد وسرطان الكبد12,13. وبالتالي ، فإن القياس الدقيق للحمل الفيروسي أمر بالغ الأهمية لتتبع تطور عدوى فيروس التهاب الكبد B وإبلاغ القرارات المتعلقة بالعلاج.
تتميز فحوصات تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمية في الوقت الفعلي بحساسية أعلى ونطاق ديناميكي أوسع وتقدير كمي أكثر دقة للحمض النووي لفيروس التهاب الكبد B مقارنة بتقنيات تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدية14،15،16،17. تتوفر في السوق العديد من مجموعات التشخيص الجزيئي التجارية القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي لتحديد كمية الحمض النووي لفيروس التهاب الكبد B في عينات المصل أو البلازما. هنا ، نصف سير عمل مفصل للكشف عن الحمض النووي لفيروس التهاب الكبد B وقياسه في المصل البشري أو البلازما باستخدام مجموعة PCR في الوقت الفعلي المتاحة تجاريا والتي تحمل علامة IVD. المجموعة عبارة عناختبار 18,19 مستخدم على نطاق واسع ، منخفض التكلفة ، ولكنه حساس للغاية ، وخصائص أدائه قابلة للمقارنة مع مجموعة (مجموعات) أخرى تحمل علامة CE المتاحة تجاريا 18. بصرف النظر عن تضخيم المنطقة المستهدفة لفيروس التهاب الكبد B ، يتم أيضا تضمين جين تحكم داخلي داخلي في المجموعة للتحقق من جودة العينات وجودة الحمض النووي المستخرج وتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل وتثبيط تفاعل البوليميراز المتسلسل المحتمل.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم تعيين رمز NIBSC 10/266 لوحدة 9،55،000 وحدة دولية / مل عند إعادة تكوينها في 0.5 مل من الماء الخالي من النيوكلياز وفقا لمعلومات المورد21. يمكن اعتبار هذا عينة إيجابية عالية الحمل HBV. كان الحمل الفيروسي HBV الذي حددته مجموعة الحمل الفيروسي المستخدمة في هذه الدراسة 6،65،900 وحدة دولية / مل (<strong …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن نعرب عن تقديرنا لبرافين وكوسوم وشاندان وإيشا وراشمي وبابلي وشيفاني وأنكيتا وشيخة لمساعدتهم الفنية.
Materials
| 4th WHO International Standard for hepatitis B virus DNA | NIBSC | NIBSC code: 10/266 | The 4th WHO International Standard for hepatitis B virus (HBV) DNA, NIBSC code 10/266, is intended to be used for the calibration of secondary reference reagents used in HBV nucleic acid amplification techniques (NAT). |
| ABI real-time PCR machines | ThermoFisher Scientific | ABI 7500; QuantStudio 5 | This is a real time PCR machine |
| HBV, HCV and HIV Multiplex 14/198 | NIBSC | NIBSC code: 14/198 | This is a very low positive triplex reagent for NAT assays containing hepatitis B (HBV), hepatitis C (HCV) and human immunodeficiency virus-1 (HIV-1) |
| QIAGEN real-time PCR machine | Qiagen | Rotor-Gene Q | This is a real time PCR machine |
| TRUPCR HBV Viral Load kit | Kilpest India Limited | 3B294 | This is a real time PCR based kit used in this study for the HBV DNA detection and viral load determination |
| TRUPCR Viral Nucleic Acid Extraction Kit | Kilpest India Limited | 3B214 | This is a DNA extraction kit used for the extraction of HBV viral DNA from NIBSC:10/266 and NIBSC:14/198 |
Referências
- Ryu, W. -. S. . Molecular Virology of Human Pathogenic Viruses. , (2016).
- Lin, X., et al. Chronic hepatitis b virus infection in the Asia-Pacific region and Africa: Review of disease progression. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 20 (6), 833-843 (2005).
- Iloeje, U. H., et al. Predicting cirrhosis risk based on the level of circulating Hepatitis B viral load. Gastroenterology. 130 (3), 678-686 (2006).
- Huang, Y. -. T., et al. Lifetime risk and sex difference of hepatocellular carcinoma among patients with chronic Hepatitis B and C. Journal of Clinical Oncology. 29 (27), 3643 (2011).
- . World Health Organization fact sheet Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets (2023)
- Watanabe, M., Toyoda, H., Kawabata, T. Rapid quantification assay of hepatitis b virus DNA in human serum and plasma by fully automated genetic analyzer mutaswako g1. PLoS One. 18 (2), e0278143 (2023).
- Chan, H. L. -. Y., et al. Viral genotype and Hepatitis B virus DNA levels are correlated with histological liver damage in HBeAg-negative chronic Hepatitis B virus infection. The American Journal of Gastroenterology. 97 (2), 406-412 (2002).
- Liu, C. J., et al. Viral factors correlate with Hepatitis B e antigen seroconverson in patients with chronic Hepatitis B. Liver International. 26 (8), 949-955 (2006).
- Liu, C. -. J., et al. Role of Hepatitis B viral load and basal core promoter mutation in hepatocellular carcinoma in Hepatitis B carriers. The Journal of Infectious Diseases. 193 (9), 1258-1265 (2006).
- Yeo, W., et al. Hepatitis B viral load predicts survival of HCC patients undergoing systemic chemotherapy. Hepatology. 45 (6), 1382-1389 (2007).
- Yim, H. J., et al. Levels of Hepatitis B virus (HBV) replication during the nonreplicative phase: HBV quantification by real-time PCR in korea. Digestive Diseases and Sciences. 52, 2403-2409 (2007).
- Noh, R., et al. Clinical impact of viral load on the development of hepatocellular carcinoma and liver-related mortality in patients with hepatitis c virus infection. Gastroenterology Research and Practice. 2016, 7476231 (2016).
- Mendy, M., et al. Hepatitis B viral load and risk for liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma in the Gambia, West Africa. Journal of Viral Hepatitis. 17 (2), 115-122 (2010).
- Abe, A., et al. Quantitation of Hepatitis B virus genomic DNA by real-time detection PCR. Journal of Clinical Microbiology. 37 (9), 2899-2903 (1999).
- Pas, S. D., Fries, E., De Man, R. A., Osterhaus, A. D., Niesters, H. G. Development of a quantitative real-time detection assay for Hepatitis B virus DNA and comparison with two commercial assays. Journal of Clinical Microbiology. 38 (8), 2897-2901 (2000).
- Ronsin, C., Pillet, A., Bali, C., Denoyel, G. R. -. A. Evaluation of the cobas ampliprep-total nucleic acid isolation-cobas Taqman Hepatitis B Virus (HBV) quantitative test and comparison to the versant HBV DNA 3.0 assay. Journal of Clinical Microbiology. 44 (4), 1390-1399 (2006).
- Sum, S. S. M., Wong, D. K. H., Yuen, J. C. H., Lai, C. L., Yuen, M. F. Comparison of the cobas taqman™ HBV test with the cobas amplicor monitor™ test for measurement of Hepatitis B virus DNA in serum. Journal of Medical Virology. 77 (4), 486-490 (2005).
- Lall, S., Choudhary, M. C., Mahajan, S., Kumar, G., Gupta, E. Performance evaluation of TRUPCR® HBV real-time PCR assay for Hepatitis B virus DNA quantification in clinical samples: Report from a tertiary care liver centre. Virusdisease. 30 (2), 186-192 (2019).
- Garg, G., et al. Presence of entry receptors and viral markers suggest a low level of placental replication of Hepatitis B virus in a proportion of pregnant women infected with chronic Hepatitis B. Scientific Reports. 12 (1), 17795 (2022).
- NIBSC-Code:10/266. . Standard for Hepatitis B Virus (Hbv) DNA for Nucleic Acid Amplification Techniques (NAT). , (2016).
- Kim, H., Hur, M., Bae, E., Lee, K. A., Lee, W. I. Performance evaluation of cobas HBV real-time PCR assay on Roche cobas 4800 system in comparison with cobas Ampliprep/cobas Taqman HBV test. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 56 (7), 1133-1139 (2018).
- Madihi, S., Syed, H., Lazar, F., Zyad, A., Benani, A. Performance comparison of the artus HBV QS-RGQ and the CAP/CTM HBV v2.0 assays regarding HEPATITIS B virus DNA quantification. BioMed Research International. 2020, 4159189 (2020).
- . Nibsc-14/198 Available from: https://www.nibsc.org/ (2023)
- Guvenir, M., Arikan, A. Hepatitis B virus: From diagnosis to treatment. Polish Journal of Microbiology. 69 (4), 391-399 (2020).
