Intrinsically disordered regions (IDR’er) er fleksible proteindomæner, der ændrer deres konformation som reaktion på miljøændringer. Ensemblefluorescensresonansenergioverførsel (FRET) kan estimere proteindimensioner under forskellige forhold. Vi præsenterer en FRET-tilgang til vurdering af IDR-strukturel følsomhed i levende Saccharomyces cerevisiae-celler under hyperosmotisk stress.
Intrinsically disordered regions (IDR’er) er proteindomæner, der deltager i afgørende cellulære processer. Under stressforhold ændres de fysisk-kemiske egenskaber i det cellulære miljø, hvilket direkte påvirker det konformationelle ensemble af IDR’er. Dybdegående undersøgelser er i sagens natur følsomme over for miljømæssige forstyrrelser. At studere, hvordan cellens fysisk-kemiske egenskaber regulerer det konformationelle ensemble af IDR’er, er afgørende for at forstå miljøkontrollen af deres funktion. Her beskriver vi en trinvis metode til måling af den strukturelle følsomhed af IDR’er i levende Saccharomyces cerevisiae-celler som reaktion på hyperosmotiske stressforhold. Vi præsenterer brugen af ensemblefluorescensresonansenergioverførsel (FRET) for at estimere, hvordan de globale dimensioner af IDR’er ændrer sig under en progressiv stigning i hyperosmotisk stress pålagt celler med enhver osmolyt. Derudover leverer vi et script til behandling af fluorescensmålinger og sammenligning af strukturel følsomhed for forskellige dybdegående undersøgelser. Ved at følge denne metode kan forskere få værdifuld indsigt i de konformationelle ændringer, som IDR’er gennemgår i det komplekse intracellulære miljø ved skiftende miljøer.
Intrinsically disordered regions (IDR’er) er kritiske komponenter i cellulære processer1. I kombination med strukturerede domæner er dybdegående undersøgelser afgørende for proteinfunktioner. Aminosyresammensætningen af IDR’er er forudindtaget, hovedsageligt repræsenteret af ladede, hydrofile og små rester. På grund af denne egenskab betragtes dybdegående undersøgelser som domæner med lav kompleksitet 2,3. Talrige dybdegående undersøgelser har fået opmærksomhed, primært fordi disse regioner spiller en afgørende rolle i patologiske tilstande, især neurodegenerative sygdomme. Sådanne sygdomme er karakteriseret ved selvmontering og efterfølgende ekstracellulær eller intracellulær aflejring af IDR’er i neuroner4. Eksempler på sådanne dybdegående undersøgelser omfatter amyloid-β (Aβ) ved Alzheimers sygdom, huntingtin (HTT) ved Huntingtons Sygdom og TAR DNA-bindende protein-43 (TDP-43) og smeltet sammen med sarkom (FUS) ved amyotrofisk lateral sklerose og frontotemporal demens4. Undersøgelsen af de strukturelle omlejringer af dybdegående undersøgelser i forbindelse med sygdom er blevet signifikant forbedret af spektroskopiske metoder, herunder fluorescensresonansenergioverførsel (FRET).
Den hydrofile og udvidede karakter af dybdegående undersøgelser gør dem ekstremt følsomme over for ændringer i opløsningsmiljøets fysisk-kemiske egenskaber5. I hvilken grad det konformationelle ensemble af IDR’er ændres af miljøet kaldes strukturel følsomhed 5,6,7. Forskellige teknikker kan anvendes til at studere de dybdegående undersøgelsers konformation og dynamik, herunder cirkulær dikroisme (CD) og småvinkel røntgenspredning (SAXS)8,9. Desværre kræver CD og SAXS store mængder oprensede proteiner, så de egner sig ikke til undersøgelser i celler. I modsætning hertil er FRET en teknik, der måler fluorescensintensiteten af to fluorescerende molekyler, der specifikt mærker en IDR, hvilket betyder, at de kan overvåges i komplekse blandinger såsom levende celler10. Dynamisk måling af den strukturelle følsomhed af IDR’er i levende celler er nødvendig for at forstå, hvordan miljøet regulerer konformationen og funktionen af det uordnede proteom.
FRET er en effektiv metode til kvantificering af den strukturelle følsomhed af dybdegående undersøgelser samt kugleformede og multidomæneproteiner i levende celler. Metoden kræver en konstruktion bestående af en IDR af interesse klemt inde mellem to fluorescerende proteiner (FP), kendt som et FRET-par. Til denne protokol foreslår vi brugen af mCerulean3 som donor-FP og Citrin som acceptor-FP på grund af deres store dynamiske område sammenlignet med andre FP’er, der er rapporteret i en tidligere undersøgelse om IDR-følsomhed6. FRET er tidligere blevet udnyttet til at måle den strukturelle følsomhed af en plante IDR i forskellige cellulære sammenhænge6. Derudover er denne teknik blevet anvendt til at karakterisere de samlede proteindimensioner af dybdegående undersøgelser af forskellige forskningsgrupper både in vitro og in vivo 5,11.
Her beskriver vi ensemble FRET-metoden til undersøgelse af den strukturelle følsomhed af IDR’er i levende gærceller (Saccharomyces cerevisiae). Vi viser repræsentative resultater, der er baseret på en plante IDR kaldet AtLEA4-5. AtLEA4-5 er uordnet i opløsning, men foldes ind i α-helix, når makromolekylær trængsel induceres in vitro12. AtLEA4-5 er en god referencemodel for denne metode, fordi den er relativt lille (158 rester), forstyrret og følsom over for miljøforstyrrelser som rapporteret in silico og in vitro 6,12. Metoden, der præsenteres her, kan skaleres til metoder med høj gennemstrømning, fordi gærceller er lette at dyrke, og behandlingen påføres i små mængder. Derudover kan små ændringer af protokollen anvendes på andre cellulære systemer såsom bakterier og planteceller6. Protokollen kan udføres i ethvert molekylærbiologisk laboratorium med adgang til en mikropladelæser med fluorescenstilstand, et udstyr, der er tilgængeligt i de fleste forskningsinstitutioner.
Den metode, der præsenteres her, giver mulighed for at få indsigt i, hvordan de globale dimensioner af ensemblet af dybdegående undersøgelser fornemmer og reagerer på miljømæssige forstyrrelser. Denne metode er afhængig af en genetisk kodet konstruktion og kræver ingen yderligere komponenter ud over et plasmidstabilt udtryk i gærceller, hvilket gør det muligt at tilpasse sig til potentielle anvendelser i andre celletyper. Desuden er det alsidigt til at udforske andre fysisk-kemiske forstyrrelser, som eukaryote…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker medlemmer af Cuevas-Velazquez-laboratoriet for den kritiske gennemgang af manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica, Dirección General de Asuntos del Personal Académico, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM-PAPIIT) projektnummer IA203422; Consejo Nacional de Humanidades, Ciencias y Tecnología (CONAHCYT), projektnummer 252952; og Programa de Apoyo a la Investigación y el Posgrado, Facultad de Química, Universidad Nacional Autónoma de México, Grant 5000-9182. CET (CVU 1083636) og CAPD (CVU 1269643) anerkender CONAHCYT for deres M.Sc. Scholarship.
96-well plate | Greiner Bio-One | 655096 | |
Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
BglII | New England BioLabs | R0144S | |
BJ5465 cells | American Type Culture Collection | 208289 | |
Buffer MES 50 mM | Sigma-Aldrich | M8250 | |
Buffer Tris-HCl 10 mM | Invitrogen | 15506017 | |
EDTA 1 mM | Merck | 108452 | |
Falcon tubes | Corning | 352057 | |
LB media | Sigma-Aldrich | L2897 | |
Lithium acetate 0.1 M | Sigma-Aldrich | L6883 | |
Low Melt Agarose | GOLDBIO | A-204-25 | |
Microcentrifuge | eppendorf | 5452000010 | |
Miniprep kit | ZymoPure | D4210 | |
NaOH 0.02 M | Merck | 106462 | |
PEG 3,350 40% | Sigma-Aldrich | 1546547 | |
plasmid pDRFLIP38-AtLEA4-5 | addgene | 178189 | |
Plate reader | BMG LABTECH | CLARIOstar Plus | |
SacI | New England BioLabs | R3156S | |
Salmon sperm DNA 2 mg/mL | Thermo Fisher Scientific | 15632011 | |
SD-Ura | Sigma-Aldrich | Y1501 | |
Sodium cloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
Taq polymesare | Promega | M5123 | |
Transiluminator | Accuris instruments | E4000 | |
UV-Visible spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Biomate3 | |
YPD media | Sigma-Aldrich | Y1500 |