FRETを用いた生細胞の高浸透圧ストレスに応答した内在性変性領域の構造感受性の推定
Summary
天然変性領域(IDR)は、環境変化に応答してコンフォメーションを変化させる柔軟なタンパク質ドメインです。アンサンブル蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)は、さまざまな条件下でタンパク質の寸法を推定できます。高浸透圧ストレス下で生きた 出芽酵母 細胞のIDR構造感受性を評価するためのFRETアプローチを提示します。
Abstract
天然変性領域(IDR)は、重要な細胞プロセスに関与するタンパク質ドメインです。ストレス状態では、細胞環境の物理化学的特性が変化し、IDRのコンフォメーションアンサンブルに直接影響します。IDRは本質的に環境の摂動に敏感です。細胞の物理化学的性質がIDRの立体構造アンサンブルをどのように制御するかを研究することは、その機能の環境制御を理解するために不可欠です。ここでは、高浸透圧ストレス条件に応答して、生きた出 芽酵母 細胞におけるIDRの構造感受性を測定するための段階的な方法について説明します。アンサンブル蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を使用して、浸透圧を有する細胞に課せられる高浸透圧ストレスの漸進的な増加中にIDRの全体的な寸法がどのように変化するかを推定します。さらに、蛍光測定を処理し、異なるIDRの構造感度を比較するためのスクリプトを提供しています。この方法に従うことで、研究者は、環境の変化に応じてIDRが複雑な細胞内環境で受ける立体構造の変化に関する貴重な洞察を得ることができます。
Introduction
天然変性領域(IDR)は、細胞プロセスにおける重要な構成要素です1。構造化ドメインと組み合わせて、IDRはタンパク質機能に不可欠です。IDRのアミノ酸組成は偏っており、主に荷電残基、親水性残基、および小残基で表されます。この特性により、IDRは複雑度の低いドメインと見なされる2,3。多くのIDRが注目されているのは、これらの領域が病態、特に神経変性疾患において重要な役割を果たしていることが主な理由です。このような疾患は、自己組織化とそれに続くニューロンにおけるIDRの細胞外または細胞内沈着を特徴とする4。例えば、アルツハイマー病のアミロイドβ(Aβ)、ハンチントン病のハンチンチン(HTT)、筋萎縮性側索硬化症や前頭側頭型認知症のTAR DNA結合タンパク質-43(TDP-43)や肉腫で融合したタンパク質(FUS)などが挙げられる4。疾患におけるIDRの構造再配列の研究は、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)などの分光法によって大幅に強化されています。
IDRの親水性と伸長性により、溶液環境の物理化学的特性の変化に非常に敏感になります5。IDRの立体配座アンサンブルが環境によって変化する度合いを構造感度5,6,7と呼ぶ。IDRの立体構造とダイナミクスの研究には、円二色性(CD)や小角X線散乱(SAXS)など、さまざまな手法が用いられます8,9。残念ながら、CDやSAXSは精製タンパク質を大量に必要とするため、細胞での研究には適していません。対照的に、FRETは、1つのIDRを特異的に標識する2つの蛍光分子の蛍光強度を測定する技術であり、生細胞などの複雑な混合物でそれらをモニターすることができることを意味する10。生細胞におけるIDRの構造感受性を動的に測定することは、環境が無秩序なプロテオームのコンフォメーションと機能をどのように制御しているかを理解するために必要です。
FRETは、生細胞内のIDR、球状タンパク質、マルチドメインタンパク質の構造感受性を定量化するための強力な方法です。この方法では、FRETペアとして知られる2つの蛍光タンパク質(FP)の間に挟まれた目的のIDRからなるコンストラクトが必要です。このプロトコルでは、IDRの感度に関する以前の研究で報告された他のFPと比較して、ダイナミックレンジが広いため、ドナーFPとしてmCerulean3を、アクセプターFPとしてシトリンを使用することを提案します6。FRETは、異なる細胞環境における植物IDRの構造的感受性を測定するために以前に利用されてきました6。さらに、この手法は、in vitroとin vivoの両方でさまざまな研究グループによってIDRの全体的なタンパク質寸法を特徴付けるために使用されています5,11。
ここでは、生きた酵母(Saccharomyces cerevisiae)細胞におけるIDRの構造感受性を研究するためのアンサンブルFRET法について説明します。AtLEA4-5と呼ばれるプラントIDRに基づく代表的な結果を示します。AtLEA4-5は溶液中で無秩序であるが、in vitroで高分子クラウディングが誘導されるとαヘリックスに折り畳まれる12。AtLEA4-5は、in silicoおよびin vitroで報告されているように、比較的小さく(158残基)、無秩序で環境摂動に敏感であるため、この方法の優れた参照モデルです6,12。ここで紹介する方法は、酵母細胞は増殖しやすく、処理量も少量であるため、ハイスループットアプローチに拡張できます。さらに、プロトコルへの小さな修正は、細菌および植物細胞6などの他の細胞系に適用することができる。このプロトコルは、ほとんどの研究機関で利用可能な機器である蛍光モードを備えたマイクロプレートリーダーにアクセスできる分子生物学研究室で行うことができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで紹介する手法は、IDRのアンサンブルのグローバルな次元が環境摂動をどのように感知し、応答するかについての洞察を得る方法を提供します。この方法は、遺伝的にコードされたコンストラクトに依存しており、酵母細胞でのプラスミドの安定発現以外に追加の成分を必要としないため、他の細胞タイプでの潜在的なアプリケーションに適応できます。さらに、真核細胞がライフサイ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cuevas-Velazquez研究室のメンバーには、原稿の批判的なレビューに感謝します。この研究は、Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica、Dirección General de Asuntos del Personal Académico、Universidad Nacional Autónoma de México(UNAM-PAPIIT)プロジェクト番号IA203422の支援を受けました。Consejo Nacional de Humanidades, Ciencias y Tecnología (CONAHCYT), プロジェクト番号 252952;Programa de Apoyo a la Investigación y el Posgrado, Facultad de Química, Universidad Nacional Autónoma de México, Grant 5000-9182.CET(CVU 1083636)およびCAPD(CVU 1269643)は、CONAHCYTの M.Sc 奨学金を認めています。
Materials
| 96-well plate | Greiner Bio-One | 655096 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| BglII | New England BioLabs | R0144S | |
| BJ5465 cells | American Type Culture Collection | 208289 | |
| Buffer MES 50 mM | Sigma-Aldrich | M8250 | |
| Buffer Tris-HCl 10 mM | Invitrogen | 15506017 | |
| EDTA 1 mM | Merck | 108452 | |
| Falcon tubes | Corning | 352057 | |
| LB media | Sigma-Aldrich | L2897 | |
| Lithium acetate 0.1 M | Sigma-Aldrich | L6883 | |
| Low Melt Agarose | GOLDBIO | A-204-25 | |
| Microcentrifuge | eppendorf | 5452000010 | |
| Miniprep kit | ZymoPure | D4210 | |
| NaOH 0.02 M | Merck | 106462 | |
| PEG 3,350 40% | Sigma-Aldrich | 1546547 | |
| plasmid pDRFLIP38-AtLEA4-5 | addgene | 178189 | |
| Plate reader | BMG LABTECH | CLARIOstar Plus | |
| SacI | New England BioLabs | R3156S | |
| Salmon sperm DNA 2 mg/mL | Thermo Fisher Scientific | 15632011 | |
| SD-Ura | Sigma-Aldrich | Y1501 | |
| Sodium cloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Taq polymesare | Promega | M5123 | |
| Transiluminator | Accuris instruments | E4000 | |
| UV-Visible spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Biomate3 | |
| YPD media | Sigma-Aldrich | Y1500 |
Referências
- Wright, P. E., Dyson, H. J. Intrinsically disordered proteins in cellular signalling and regulation. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (1), 18-29 (2015).
- Covarrubias, A. A., Romero-Pérez, P. S., Cuevas-Velazquez, C. L., Rendón-Luna, D. F. The functional diversity of structural disorder in plant proteins. Arch Biochem Biophys. 680, 108229 (2019).
- Ahmed, S. S., et al. Characterization of intrinsically disordered regions in proteins informed by human genetic diversity. PLoS Comput Biol. 18 (3), e1009911 (2022).
- Birol, M., Melo, A. M. Untangling the conformational polymorphism of disordered proteins associated with neurodegeneration at the single-molecule level. Front Mol Neurosci. 12, 309 (2019).
- Moses, D., et al. Revealing the hidden sensitivity of intrinsically disordered proteins to their chemical environment. J Phys Chem Lett. 11 (23), 10131-10136 (2020).
- Cuevas-Velazquez, C. L., et al. Intrinsically disordered protein biosensor tracks the physical-chemical effects of osmotic stress on cells. Nat Commun. 12 (1), 5438 (2021).
- Holehouse, A. S., Sukenik, S. Controlling structural bias in intrinsically disordered proteins using solution space scanning. J Chem Theory Comput. 16 (3), 1794-1805 (2020).
- Martin, E. W., Hopkins, J. B., Mittag, T. Small-angle X-ray scattering experiments of monodisperse intrinsically disordered protein samples close to the solubility limit. Methods Enzymol. 646, 185-222 (2021).
- Miles, A. J., Drew, E. D., Wallace, B. A. DichroIDP: a method for analyses of intrinsically disordered proteins using circular dichroism spectroscopy. Commun Biol. 6 (1), 823 (2023).
- Kaminski, C. F., Rees, E. J., Schierle, G. S. K. A quantitative protocol for intensity-based live cell FRET imaging. Method Mol Biol. 1076, 445-454 (2014).
- Moses, D., et al. Structural biases in disordered proteins are prevalent in the cell. bioRxiv. , (2022).
- Cuevas-Velazquez, C. L., Saab-Rincón, G., Reyes, J. L., Covarrubias, A. A. The Unstructured N-terminal Region of Arabidopsis Group 4 Late Embryogenesis Abundant (LEA) Proteins Is Required for Folding and for Chaperone-like Activity under Water Deficit. J Biol Chem. 291 (20), 10893-10903 (2016).
- JoVE Science Education Database. . Restriction enzyme digests. , (2023).
- JoVE Science Education Database. . Gel purification. , (2023).
- JoVE Science Education Database. . DNA ligation reactions. , (2023).
- JoVE Science Education Database. . Bacterial transformation using heat Ssock and competent cells. , (2023).
- JoVE Science Education Database. . PCR: Principle, instrumentation, and applications. , (2023).
- JoVE Science Education Database. . Plasmid purification. , (2023).
- JoVE Science Education Database. . DNA gel electrophoresis. , (2023).
- JoVE Core Molecular Biology. Sanger/chain termination sequencing using dideoxynucleotides – Concept Available from: https://app.jove.com/science-education/v/12020/sanger-sequencing (2023)
- Theillet, F. X., et al. Physicochemical properties of cells and their effects on intrinsically disordered proteins (IDPs). Chem Rev. 114 (13), 6661-6714 (2014).
- Brutscher, B., et al. NMR methods for the study of instrinsically disordered proteins structure, dynamics, and interactions: General overview and practical guidelines. Adv Exp Med Biol. 870, 49-122 (2015).
- Metskas, L. A., Rhoades, E. Single-molecule FRET of intrinsically disordered proteins. Annu Rev Phys Chem. 71, 391-414 (2020).
- Roebroek, T., et al. Simultaneous readout of multiple FRET pairs using photochromism. Nat Commun. 12 (1), 2005 (2021).
- Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. FRET as a biomolecular research tool – understanding its potential while avoiding pitfalls. Nat Methods. 16 (9), 815-829 (2019).
- Lyon, A. S., Peeples, W. B., Rosen, M. K. A framework for understanding the functions of biomolecular condensates across scales. Nat Rev Mol Cell Biol. 22 (3), 215-235 (2021).
- Belott, C., Janis, B., Menze, M. A. Liquid-liquid phase separation promotes animal desiccation tolerance. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (44), 27676-27684 (2020).
- Miermont, A., et al. Severe osmotic compression triggers a slowdown of intracellular signaling, which can be explained by molecular crowding. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (14), 5725-5730 (2013).
- Saito, H., Posas, F. Response to hyperosmotic stress. Genética. 192 (2), 289-318 (2012).
- Selenko, P., Wagner, G. Looking into live cells with in-cell NMR spectroscopy. J Struct Biol. 158 (2), 244-253 (2007).
- Cattani, J., Subramaniam, V., Drescher, M. Room-temperature in-cell EPR spectroscopy: alpha-Synuclein disease variants remain intrinsically disordered in the cell. Phys Chem Chem Phys. 19 (28), 18147-18151 (2017).
- Beveridge, R., Chappuis, Q., Macphee, C., Barran, P. Mass spectrometry methods for intrinsically disordered proteins. Analyst. 138 (1), 32-42 (2013).
- Beveridge, R., et al. Ion mobility mass spectrometry uncovers the impact of the patterning of oppositely charged residues on the conformational distributions of intrinsically disordered proteins. J Am Chem Soc. 141 (12), 4908-4918 (2019).
