झल्लाहट का उपयोग कर जीवित कोशिकाओं में hyperosmotic तनाव के जवाब में आंतरिक रूप से अव्यवस्थित क्षेत्रों की संरचनात्मक संवेदनशीलता का अनुमान
Summary
आंतरिक रूप से अव्यवस्थित क्षेत्र (आईडीआर) लचीले प्रोटीन डोमेन हैं जो पर्यावरणीय परिवर्तनों के जवाब में उनकी रचना को संशोधित करते हैं। पहनावा प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) विभिन्न परिस्थितियों में प्रोटीन आयामों का अनुमान लगा सकते हैं. हम हाइपरोस्मोटिक तनाव के तहत जीवित Saccharomyces cerevisiae कोशिकाओं में IDR संरचनात्मक संवेदनशीलता का आकलन करने के लिए एक झल्लाहट दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
आंतरिक रूप से अव्यवस्थित क्षेत्र (आईडीआर) प्रोटीन डोमेन हैं जो महत्वपूर्ण सेलुलर प्रक्रियाओं में भाग लेते हैं। तनाव की स्थिति के दौरान, सेलुलर वातावरण के भौतिक रासायनिक गुण बदलते हैं, सीधे आईडीआर के संरूपण पहनावा को प्रभावित करते हैं। आईडीआर पर्यावरणीय गड़बड़ी के प्रति स्वाभाविक रूप से संवेदनशील हैं। यह अध्ययन करना कि कोशिका के भौतिक रासायनिक गुण आईडीआर के संरूपण पहनावा को कैसे नियंत्रित करते हैं, उनके कार्य के पर्यावरण नियंत्रण को समझने के लिए आवश्यक है। यहां, हम हाइपरोस्मोटिक तनाव स्थितियों के जवाब में जीवित सैक्रोमाइसेस सेरेविसिया कोशिकाओं में आईडीआर की संरचनात्मक संवेदनशीलता को मापने के लिए चरण-दर-चरण विधि का वर्णन करते हैं। हम पहनावा प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) का उपयोग प्रस्तुत करते हैं ताकि यह अनुमान लगाया जा सके कि किसी भी ऑस्मोलाइट के साथ कोशिकाओं पर लगाए गए हाइपरोस्मोटिक तनाव की प्रगतिशील वृद्धि के दौरान आईडीआर के वैश्विक आयाम कैसे बदलते हैं। इसके अलावा, हम प्रतिदीप्ति माप प्रसंस्करण और विभिन्न IDRs के लिए संरचनात्मक संवेदनशीलता की तुलना के लिए एक स्क्रिप्ट प्रदान करते हैं. इस पद्धति का पालन करके, शोधकर्ता उन रचनात्मक परिवर्तनों में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्राप्त कर सकते हैं जो बदलते वातावरण पर जटिल इंट्रासेल्युलर परिवेश में आईडीआर से गुजरते हैं।
Introduction
आंतरिक रूप से अव्यवस्थित क्षेत्र (आईडीआर) सेलुलर प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण घटक हैं1. संरचित डोमेन के साथ संयोजन में, आईडीआर प्रोटीन कार्यों के लिए आवश्यक हैं। आईडीआर की अमीनो एसिड संरचना पक्षपाती है, मुख्य रूप से चार्ज, हाइड्रोफिलिक और छोटे अवशेषों द्वारा दर्शाई जाती है। इस संपत्ति के कारण, IDRs कम जटिलताडोमेन 2,3 माना जाता है. कई आईडीआर ने ध्यान आकर्षित किया है, मुख्यतः क्योंकि ये क्षेत्र रोग संबंधी स्थितियों, विशेष रूप से न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। इस तरह के रोगों को स्व-विधानसभा और बाद मेंन्यूरॉन्स 4 में आईडीआर के बाह्य या इंट्रासेल्युलर जमाव की विशेषता है। ऐसे आईडीआर के उदाहरणों में अल्जाइमर रोग में अमाइलॉइड-β (एβ), हंटिंगटन रोग में हंटिंगिन (एचटीटी), और टीएआर डीएनए-बाइंडिंग प्रोटीन -43 (टीडीपी -43) और एमियोट्रोफिक लेटरल स्क्लेरोसिस और फ्रंटोटेम्पोरल डिमेंशिया4 में सारकोमा (एफयूएस) में फ्यूज किया गया है। रोग के संदर्भ में आईडीआर के संरचनात्मक पुनर्व्यवस्था के अध्ययन को स्पेक्ट्रोस्कोपिक विधियों द्वारा काफी बढ़ाया गया है, जिसमें प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) शामिल है।
आईडीआर की हाइड्रोफिलिक और विस्तारित प्रकृति उन्हें समाधान पर्यावरण के भौतिक रासायनिक गुणों में परिवर्तन के प्रति बेहद संवेदनशील बनातीहै। डिग्री जिसके द्वारा आईडीआर के conformational पहनावा पर्यावरण द्वारा संशोधित संरचनात्मक संवेदनशीलता 5,6,7 कहा जाता है. विभिन्न तकनीकों परिपत्र dichroism (सीडी) और छोटे कोण एक्स-रे बिखरने (एसएएक्सएस)8,9सहित आईडीआर की संरचना और गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. दुर्भाग्य से, सीडी और एसएएक्सएस को बड़ी मात्रा में शुद्ध प्रोटीन की आवश्यकता होती है, इसलिए वे कोशिकाओं में अध्ययन के लिए उपयुक्त नहीं हैं। इसके विपरीत, झल्लाहट एक तकनीक है कि दो फ्लोरोसेंट अणुओं है कि विशेष रूप से एक IDR लेबल, जिसका अर्थ है कि वे इस तरह के जीवित कोशिकाओं10 के रूप में जटिल मिश्रण में निगरानी की जा सकती है की प्रतिदीप्ति तीव्रता उपाय है. जीवित कोशिकाओं में आईडीआर की संरचनात्मक संवेदनशीलता को गतिशील रूप से मापना यह समझने के लिए आवश्यक है कि पर्यावरण अव्यवस्थित प्रोटिओम के विरूपण और कार्य को कैसे नियंत्रित करता है।
झल्लाहट IDRs की संरचनात्मक संवेदनशीलता यों के साथ-साथ जीवित कोशिकाओं में गोलाकार और multidomain प्रोटीन यों के लिए एक शक्तिशाली विधि है. विधि के लिए एक निर्माण की आवश्यकता होती है जिसमें दो फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एफपी) के बीच सैंडविच किए गए ब्याज की आईडीआर होती है, जिसे झल्लाहट जोड़ी के रूप में जाना जाता है। इस प्रोटोकॉल के लिए, हम दाता FP और स्वीकर्ता FP के रूप में Citrine के रूप में mCerulean3 के उपयोग का सुझाव, क्योंकि उनकी बड़ी गतिशील रेंज की, IDRs संवेदनशीलता6 के बारे में एक पिछले अध्ययन में रिपोर्ट अन्य FPs की तुलना में. झल्लाहट पहले विभिन्न सेलुलर संदर्भों 6 में एक संयंत्र आईडीआर की संरचनात्मक संवेदनशीलता कोमापने के लिए शोषण किया गया है। इसके अलावा, इस तकनीक का उपयोग इन विट्रो और विवो 5,11 दोनों में विभिन्न अनुसंधान समूहों द्वारा आईडीआर के समग्र प्रोटीन आयामों को चिह्नित करने के लिए किया गया है।
यहाँ, हम जीवित खमीर (Saccharomyces cerevisiae) कोशिकाओं में IDRs की संरचनात्मक संवेदनशीलता का अध्ययन करने के लिए पहनावा झल्लाहट विधि का वर्णन. हम प्रतिनिधि परिणाम दिखाते हैं जो AtLEA4-5 नामक प्लांट IDR में आधारित हैं। AtLEA4-5 समाधान में अव्यवस्थित है, लेकिन α-हेलिक्स में सिलवटों जब macromolecular भीड़ इन विट्रो12 में प्रेरित है. AtLEA4-5 इस विधि के लिए एक अच्छा संदर्भ मॉडल है क्योंकि यह अपेक्षाकृत छोटा (158 अवशेष), अव्यवस्थित और पर्यावरणीय गड़बड़ी के प्रति संवेदनशील है जैसा कि सिलिको और इन विट्रो 6,12 में बताया गया है। यहां प्रस्तुत विधि को उच्च थ्रूपुट दृष्टिकोण के लिए बढ़ाया जा सकता है क्योंकि खमीर कोशिकाओं को विकसित करना आसान होता है, और उपचार छोटी मात्रा में लागू होता है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल के लिए छोटे संशोधनों इस तरह के बैक्टीरिया और संयंत्र कोशिकाओं 6 के रूप में अन्य सेलुलर प्रणालियों के लिए लागू किया जा सकताहै. प्रोटोकॉल प्रतिदीप्ति मोड के साथ एक माइक्रोप्लेट पाठक के लिए उपयोग के साथ किसी भी आणविक जीव विज्ञान प्रयोगशाला में प्रदर्शन किया जा सकता है, एक उपकरण सबसे अनुसंधान संस्थानों में उपलब्ध है.
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां प्रस्तुत विधि अंतर्दृष्टि प्राप्त करने का एक तरीका प्रदान करती है कि आईडीआर के कलाकारों की टुकड़ी के वैश्विक आयाम कैसे समझते हैं और पर्यावरणीय गड़बड़ी का जवाब देते हैं। यह विधि आनुवंशिक रूप से ए?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम पांडुलिपि की महत्वपूर्ण समीक्षा के लिए क्यूवास-वेलाज़केज़ प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद देते हैं। इस काम को Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica, Dirección General de Asuntos del Personal Académico, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM-PAPIIT) प्रोजेक्ट नंबर IA203422; Consejo Nacional de Humanidades, Ciencias y Tecnología (CONAHCYT), परियोजना संख्या 252952; और Programa de Apoyo a la Investigación y el Posgrado, Facultad de Química, Universidad Nacional Autónoma de México, Grant 5000-9182। CET (CVU 1083636) और CAPD (CVU 1269643) अपने M.Sc छात्रवृत्ति के लिए CONAHCYT को स्वीकार करते हैं।
Materials
| 96-well plate | Greiner Bio-One | 655096 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| BglII | New England BioLabs | R0144S | |
| BJ5465 cells | American Type Culture Collection | 208289 | |
| Buffer MES 50 mM | Sigma-Aldrich | M8250 | |
| Buffer Tris-HCl 10 mM | Invitrogen | 15506017 | |
| EDTA 1 mM | Merck | 108452 | |
| Falcon tubes | Corning | 352057 | |
| LB media | Sigma-Aldrich | L2897 | |
| Lithium acetate 0.1 M | Sigma-Aldrich | L6883 | |
| Low Melt Agarose | GOLDBIO | A-204-25 | |
| Microcentrifuge | eppendorf | 5452000010 | |
| Miniprep kit | ZymoPure | D4210 | |
| NaOH 0.02 M | Merck | 106462 | |
| PEG 3,350 40% | Sigma-Aldrich | 1546547 | |
| plasmid pDRFLIP38-AtLEA4-5 | addgene | 178189 | |
| Plate reader | BMG LABTECH | CLARIOstar Plus | |
| SacI | New England BioLabs | R3156S | |
| Salmon sperm DNA 2 mg/mL | Thermo Fisher Scientific | 15632011 | |
| SD-Ura | Sigma-Aldrich | Y1501 | |
| Sodium cloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Taq polymesare | Promega | M5123 | |
| Transiluminator | Accuris instruments | E4000 | |
| UV-Visible spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Biomate3 | |
| YPD media | Sigma-Aldrich | Y1500 |
Referências
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