Regiões intrinsecamente desordenadas (IDRs) são domínios proteicos flexíveis que modificam sua conformação em resposta a mudanças ambientais. A transferência de energia por ressonância de fluorescência em conjunto (FRET) pode estimar as dimensões da proteína sob diferentes condições. Apresentamos uma abordagem FRET para avaliar a sensibilidade estrutural da IDR em células vivas de Saccharomyces cerevisiae sob estresse hiperosmótico.
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Artigo de método
Estimativa da Sensibilidade Estrutural de Regiões Intrinsecamente Desordenadas em Resposta ao Estresse Hiperosmótico em Células Vivas Utilizando FRET
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Neste artigo
Resumo
Resumo
Regiões intrinsecamente desordenadas (IDRs) são domínios proteicos que participam de processos celulares cruciais. Durante as condições de estresse, as propriedades físico-químicas do ambiente celular mudam, impactando diretamente o conjunto conformacional das IDRs. As IDRs são inerentemente sensíveis a perturbações ambientais. Estudar como as propriedades físico-químicas da célula regulam o conjunto conformacional de IDRs é essencial para a compreensão do controle ambiental de sua função. Aqui, descrevemos um método passo-a-passo para medir a sensibilidade estrutural de IDRs em células vivas de Saccharomyces cerevisiae em resposta a condições de estresse hiperosmótico. Apresentamos o uso da transferência de energia por ressonância de fluorescência de conjunto (FRET) para estimar como as dimensões globais das IDRs mudam durante um aumento progressivo do estresse hiperosmótico imposto às células com qualquer osmólito. Além disso, fornecemos um script para processar medições de fluorescência e comparar a sensibilidade estrutural para diferentes IDRs. Seguindo esse método, os pesquisadores podem obter informações valiosas sobre as mudanças conformacionais que as IDRs sofrem no complexo meio intracelular ao mudar ambientes.
Introdução
Regiões intrinsecamente desordenadas (IDRs) são componentes críticos nos processos celulares1. Em combinação com domínios estruturados, as IDRs são essenciais para as funções proteicas. A composição de aminoácidos das IDRs é tendenciosa, representada principalmente por resíduos carregados, hidrofílicos e pequenos. Devido a essa propriedade, os IDRs são considerados domínios de baixa complexidade 2,3. Numerosas IDRs têm chamado a atenção, principalmente porque essas regiões desempenham um papel crucial em condições patológicas, particularmente doenças neurodegenerativas. Tais doenças car....
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Protocolo
1. Construção do plasmídeo
- Amplificar o quadro de leitura aberto (ORF) que codifica o IDR desejado por reação em cadeia da polimerase (PCR). Não inclua o códon stop, pois a ORF será ladeada pelos genes que codificam as proteínas fluorescentes. Para a amplificação, foram projetados primers com os sítios de restrição SacI (5') e BglII (3').
NOTA: Para a seção de resultados representativos, usamos AtLEA4-5 como o IDR selecionado. Amplificamos a ORF de AtLEA4-5 a partir do plasmídeo pTrc99A-AtLEA4-512. - Digerir o produto da PCR ORF por restrição consecutiva com as enzimas SacI e ....
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Resultados
Após a transformação das células de levedura com o plasmídeo pDRFLIP38-AtLEA4-5, a fluorescência dos transformadores positivos foi observada com um transiluminador de luz azul e um filtro (Figura 1). O preparo das diferentes soluções para induzir estresse hiperosmótico é demorado, por isso sugerimos seguir o molde de 96 poços da Figura 2. Imediatamente após o tratamento do estresse hiperosmótico com concentrações variáveis de cloreto de sódio, os espectros de em.......
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Discussão
O método apresentado aqui oferece uma maneira de obter insights sobre como as dimensões globais do conjunto de IDRs sentem e respondem a perturbações ambientais. Este método baseia-se em uma construção geneticamente codificada e não requer componentes adicionais além de uma expressão estável de plasmídio em células de levedura, tornando-o adaptável para aplicações potenciais em outros tipos celulares. Além disso, é versátil para explorar outras perturbações físico-químicas que as células eucarióticas experimentam durante.......
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Divulgações
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Agradecimentos
Agradecemos aos membros do laboratório Cuevas-Velazquez pela revisão crítica do manuscrito. Este trabalho foi apoiado pelo Projeto IA203422 Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica, Dirección General de Asuntos del Personal Académico, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM-PAPIIT); Consejo Nacional de Humanidades, Ciencias y Tecnología (CONAHCYT), projeto número 252952; e Programa de Apoyo a la Investigación y el Posgrado, Facultad de Química, Universidad Nacional Autónoma de México, Grant 5000-9182. CET (CVU 1083636) e CAPD (CVU 1269643) reconhecem a CONAHCYT por sua bolsa de M.Sc.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Placa de 96 poços | Greiner Bio-One | 655096 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| BglII | New England BioLabs | R0144S | |
| BJ5465 células | American Type Culture Collection | 208289 | |
| Buffer MES 50 | mM Sigma-Aldrich | M8250 | |
| Buffer Tris-HCl 10 mM | Invitrogen | ||
| EDTA 1 mM | Tubos Merck | 108452 | |
| Falcon | Corning | 352057 | |
| LB | Sigma-Aldrich | L2897 | |
| Acetato de lítio 0,1 M | Sigma-Aldrich | L6883 | |
| Low Melt Agarose | GOLDBIO | A-204-25 | |
| Microcentrífuga | eppendorf | 5452000010 | |
| Kit Miniprep | ZymoPure | D4210 | |
| NaOH 0,02 M | Merck | 106462 | |
| PEG 3.350 40% | Sigma-Aldrich | 1546547 | |
| plasmídeo pDRFLIP38-AtLEA4-5 | addgene | 178189 | |
| Leitor de placas | BMG LABTECH | CLARIOstar Plus | |
| SacI | New England BioLabs | R3156S | |
| DNA de esperma de salmão 2 mg / mL | Thermo Fisher Scientific | 15632011 | |
| SD-Ura | Sigma-Aldrich | Y1501 | |
| Cloreto de sódio | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Taq polymesare | Promega | M5123 | |
| Transiluminador | Accuris instrumentos | E4000 | |
| Espectrofotômetro UV-Visível | Thermo Fisher Scientific | Biomate3 | |
| YPD mídia | Sigma-Aldrich | Y1500 |
Referências
- Wright, P. E., Dyson, H. J. Intrinsically disordered proteins in cellular signalling and regulation. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (1), 18-29 (2015).
- Covarrubias, A. A., Romero-Pérez, P. S., Cuevas-Velazquez, C. L., Rendón-Luna, D. F. The functional diversity of struc....
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Reimpressões e permissões
