אסטרטגיה לביו-בנקאות של אורגנואידים של סרטן השחלות: טיפול בהטרוגניות הבין-אשפוזית על פני תת-סוגים היסטולוגיים ושלבי מחלה
Summary
פרוטוקול זה מציע מסגרת שיטתית להקמת אורגנואידים של סרטן השחלות משלבי מחלה שונים ונותן מענה לאתגרים של שונות ספציפית למטופלת כדי להגדיל את התשואה ולאפשר התרחבות חזקה לטווח ארוך ליישומים הבאים. הוא כולל שלבים מפורטים לעיבוד רקמות, זריעה, התאמת דרישות מדיה וצביעה אימונופלואורסצנטית.
Abstract
בעוד הקמת ביובנק לסרטן השחלות מאורגנואידים שמקורם במטופלות יחד עם מידע הרקע הקליני שלהם מבטיח התקדמות במחקר ובטיפול בחולים, סטנדרטיזציה נותרה אתגר בשל ההטרוגניות של ממאירות קטלנית זו, בשילוב עם המורכבות האינהרנטית של טכנולוגיית אורגנואידים. פרוטוקול הסתגלות זה מספק מסגרת שיטתית למימוש מלוא הפוטנציאל של אורגנואידים של סרטן השחלות, בהתחשב בשונות ספציפית למטופלת של אבות. על ידי יישום זרימת עבודה ניסיונית מובנית לבחירת תנאי תרבית ושיטות זריעה אופטימליים, עם בדיקות מקבילות של זריעה תלת-ממדית ישירה לעומת מסלול דו-ממדי/תלת-ממדי, אנו משיגים, ברוב המקרים, קווים מתרחבים ארוכי טווח חזקים המתאימים למגוון רחב של יישומים במורד הזרם.
יש לציין כי הפרוטוקול נבדק והוכח כיעיל במספר רב של מקרים (N = 120) של חומר מוצא הטרוגני מאוד, כולל סרטן שחלות בדרגה גבוהה ובדרגה נמוכה ושלבי המחלה עם debulking ראשוני, מחלה חוזרת ודגימות כירורגיות פוסט-ניאו-אדג’ובנטיות. בתוך סביבת איתות אקסוגנית נמוכה של Wnt ו-BMP גבוה, ראינו אבות רגישים באופן שונה להפעלת מסלול Heregulin 1 ß (HERß-1), כאשר HERß-1 מקדם היווצרות אורגנואידים בחלק מהמקרים ומעכב אותו באחרים. עבור תת-קבוצה של דגימות המטופל, היווצרות אורגנואידים אופטימלית וצמיחה ארוכת טווח מחייבים תוספת של גורם גדילה פיברובלסט 10 ו- R-Spondin 1 למדיום.
יתר על כן, אנו מדגישים את השלבים הקריטיים של עיכול רקמות ובידוד אבות ומצביעים על דוגמאות שבהן טיפוח קצר בדו-ממד על פלסטיק מועיל להיווצרות אורגנואידים לאחר מכן במטריצה מסוג 2 של תמצית קרום מרתף. בסך הכל, ביו-בנקאות אופטימלית דורשת בדיקה שיטתית של כל התנאים העיקריים במקביל כדי לזהות סביבת גידול נאותה עבור קווים בודדים. הפרוטוקול מתאר גם את הליך הטיפול בהטבעה, חתך וצביעה יעילים לקבלת תמונות ברזולוציה גבוהה של אורגנואידים, הנדרשת לפנוטיפ מקיף.
Introduction
הניהול הקליני של חולות עם סרטן שחלות אפיתל נותר מאתגר בשל הצגתו הקלינית ההטרוגנית בשלבים מתקדמים ושיעורי הישנות גבוהים1. שיפור הבנתנו את התפתחות סרטן השחלות וההתנהגות הביולוגית דורש גישות מחקריות המתייחסות לשונות הספציפית למטופלת במהלך המחלה, תגובה לטיפול ותכונות היסטופתולוגיות ומולקולריות2.
ביו-בנק, המאופיין באיסוף שיטתי ושימור ארוך טווח של דגימות גידול שמקורן בחולות סרטן השחלות, יחד עם המידע הקליני שלהן, מציע שימור של קבוצת חולים גדולה בשלבי מחלה שונים, כולל דגימות גידול מניתוחי דה-בולקציה ראשוניים, לאחר כימותרפיה ניאו-אדג’ובנטית וממחלות חוזרות. הוא טומן בחובו פוטנציאל רב ערך לקידום חקר הסרטן, ומשמש כמשאב של סמנים ביולוגיים פרוגנוסטיים מבטיחים ומטרות טיפוליות3. עם זאת, שיטות ביו-בנקאיות קונבנציונליות, כגון קיבוע פורמלין והקפאה, אינן מקובלות לביצוע מחקרים פונקציונליים על דגימות הגידול המקוריות בשל אובדן הכדאיות ושיבוש ארכיטקטורת הרקמה התלת-ממדית המקורית 4,5.
מחקרים על מנגנונים מולקולריים, באונקולוגיה ומחוצה לה, תלויים באופן מכריע בשימוש במודלים ניסיוניים מתאימים המשקפים נאמנה את הביולוגיה של המחלה ושומרים על תכונות חוץ גופיות של הרקמה שנצפתה in vivo. אורגנואידים שמקורם במטופל, המבוססים על שימור פוטנציאל ההתחדשות, משחזרים במעבדה את המבנה והתפקוד המקוריים של האפיתל ומאפשרים בדיקה בהקשר ספציפי למטופל. לכן, הם התגלו ככלים מבטיחים ביותר לחקר הסרטן ולרפואה מותאמת אישית, המגשרים על הפער בין מגוון קליני למחקר מעבדה 6,7,8,9. אסטרטגיות טיפוליות מותאמות אישית המבוססות על תגובות תרופתיות אינדיבידואליות של קווי אורגנואידים ובדיקת הרלוונטיות התפקודית של פרופילים מולקולריים, יכולות להיות מיושמות ישירות בטיפול בחולה10,11. האפשרות של טיפוח לטווח ארוך, כולל מאפיינים ספציפיים למטופל ואיסוף נתונים קליניים פרוספקטיביים רלוונטיים לאורך זמן, טומנת בחובה הבטחה גדולה לזיהוי גורמים פרוגנוסטיים ומנבאים חדשים המעורבים בהתקדמות המחלה ובמנגנוני התנגדות 3,9.
עם זאת, בניית ביובנק הכולל אורגנואידים מדגימות גידולים שונות דורשת שילוב של הקפדה על מתודולוגיה מורכבת וקביעת פרוטוקולים לתחזוקה קלה12. סטנדרטיזציה של תהליכים מבטיחה כי ניתן להקים ולתחזק את הביובנק ביעילות על ידי צוות מיומן גם בתחלופה גבוהה, תוך שמירה על תקני האיכות הגבוהים ביותר13. מספר מחקרים דיווחו על יצירה מוצלחת של קווי אורגנואידים יציבים של סרטן השחלות המתאימים לפרופיל המוטציוני והפנוטיפי של הגידול המקורי עם שיעורי יעילות משתנים. עם זאת, בנקאות ביולוגית שגרתית נותרה מאתגרת בפועל, במיוחד עבור צמיחה יציבה לטווח ארוך של קווים, שהיא תנאי מוקדם להרחבה בקנה מידה גדול או עריכה גנומית מוצלחת.
בפרט, נושא יכולת ההתרחבות נותר מוגדר באופן מעורפל בתחום שכן אורגנואידים המראים פוטנציאל צמיחה איטי ומוגבל נספרים לעיתים כקווים מבוססים. כפי שהודגם לראשונה על ידי הופמן ועמיתיו, מחקר שממצאיו העיקריים היוו את הבסיס לפרוטוקול מפותח זה, טיפול אופטימלי ברקמת סרטן השחלות דורש אסטרטגיה ייחודית כדי להתאים להטרוגניות14. אפיון פנוטיפי של האורגנואידים המתקבלים בשיטה זו ודמיון הדוק לרקמת הגידול ההורית אושרו על ידי ריצוף DNA פאנל וניתוח שעתוק של תרביות בוגרות (4-10 חודשי טיפוח) המדגימים את יציבות המודל 8,9,12,14.
בניגוד לסביבה הפרקרינית המווסתת את ההומאוסטזיס בחצוצרות הבריאות, שכבת האפיתל, שככל הנראה מניבה סרטן שחלות סרוסי בדרגה גבוהה (HGSOC), פוטנציאל התחדשות סרטן ויכולת היווצרות אורגנואידים, תלויה פחות בתוספי Wnt אקסוגניים. יתר על כן, איתות חלבון מורפוגנטי עצם פעיל (BMP), המאופיין בהיעדר Noggin בתווך אורגנואידי, הוכח כמועיל להקמת תרביות ארוכות טווח ממשקעי רקמה מוצקה של סרטן השחלות14,15. במהלך ביו-בנקאות שיטתית של מרבצים מוצקים של סרטן השחלות, אישרנו ממצאים אלה והקמנו את הצינור, עם פרטים המתוארים בפרוטוקול זה המבטיחים התרחבות מתמשכת לטווח ארוך ברוב המקרים. אנו מוצאים כי בדיקות מקבילות של הרכבי מדיה שונים ושיטות זריעה בעת עבודה עם מבודדים ראשוניים חיוניות לשיפור הקמתם של קווי אורגנואידים יציבים ארוכי טווח ולהגדלת התשואות המאפשרות התפשטות והרחבה חזקות לפורמטים מרובי בארות הדרושים לניסויים במורד הזרם16.
יתר על כן, טוהר ואיכות הדגימות שנאספו במהלך הניתוח הם בעלי חשיבות מכרעת לפוטנציאל התרגומי של אורגנואידים של סרטן השחלות במחקר בסיסי ובאבחון מולקולרי. המורכבות של ההצגה הקלינית של HGSOC דורשת שיתוף פעולה הדוק בין המנתחים, האונקולוגים והמדענים במעבדה כדי להבטיח שהחומר הרלוונטי מזוהה נכון, תנאי ההובלה נשמרים קבועים, וקווי אורגנואידים נוצרים ביעילות גבוהה המייצגת את המאפיינים החשובים ביותר של המחלה של כל חולה. פרוטוקול זה מספק מסגרת סטנדרטית אך ניתנת להתאמה כדי ללכוד את מלוא הפוטנציאל של אורגנואידים של סרטן השחלות, בהתחשב בהטרוגניות המאפיינת את סרטן השחלות16,17. יש לציין כי פרוטוקול זה מאפשר ביו-בנק אמין של הספקטרום הרחב של ההצגה הקלינית של סרטן השחלות, כולל סוגים היסטולוגיים שונים (סרטן שחלות בדרגה גבוהה ובדרגה נמוכה, LGSOC), משקעים שונים מאותם חולים המציגים הבדלים בוויסות גזע, רקמות מניתוחים במצב פוסט-ניאו-אדג’ובנטי, חומר ביופסיה ודגימות מניתוחים בשלב החוזר של התקדמות המחלה.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המתוכנן מתייחס לאתגרים קודמים של ביו-בנקאות אורגנואידית של סרטן השחלות ביחס להיווצרות אורגנואידים ופוטנציאל מעבר ארוך טווח ומבטיח יצירת קווים הניתנים להרחבה מלאה מרוב משקעי הגידול המוצקים. תהליך האיסוף הכירורגי של דגימות גידול שישמשו לייצור אורגנואידים משפיע באופן משמעותי ע…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחקר ממומן על ידי המרכז הגרמני לחקר הסרטן DKTK, אתר שותף מינכן, שותפות בין DKFZ ובית החולים האוניברסיטאי LMU מינכן. המחקר נתמך גם על ידי מענק הסיוע הגרמני לסרטן (#70113426 ו- #70113433). הטבעה של פרפין של רקמות ואורגנואידים בוצעה במתקן הליבה של המכון לאנטומיה, הפקולטה לרפואה, LMU מינכן, מינכן. הדמיה קונפוקלית בוצעה במתקן הליבה הדמיה ביולוגית במרכז הביו-רפואי (BMC). המחברים רוצים להודות לסימון הופמן, מריה פישר, קורנליה הרבסט, סבין פינק ומרטינה רחמה, על העזרה הטכנית.
Materials
| 100 Sterican 26 G | Braun, Melsungen, Germany | 4657683 | |
| 100 Sterican 27 G | Braun, Melsungen, Germany | 4657705 | |
| 293T HA Rspo1-Fc | R&D systems, Minneapolis, USA | 3710-001-01 | Alternative: R-Spondin1 expressing Cell line, Sigma-Aldrich, SC111 |
| A-83-01 (TGF-b RI Kinase inhibitor IV) | Merck, Darmstadt, Germany | 616454 | |
| Advanced DMEM/F-12 Medium | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 12634028 | |
| Anti-p53 antibody (DO1) | Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA | sc-126 | |
| Anti-PAX8 antibody | Proteintech, Manchester, UK | 10336-1-AP | |
| B-27 Supplement (50x) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 17504-044 | |
| Bottle-top vacuum filter 0.2 µm | Corning, Berlin, Germany | 430049 | |
| CELLSTAR cell culture flask, 175 cm2 | Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria | 661175 | |
| CELLSTAR cell culture flask, 25 cm2 | Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria | 690160 | |
| CELLSTAR cell culture flask, 75 cm2 | Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria | 658175 | |
| Collagenase I | Thermo Scientific, Waltham, USA | 17018029 | |
| Costar 48-well Clear TC-treated | Corning, Berlin, Germany | 3548 | |
| Cryo SFM | PromoCell – Human Centered Science, Heidelberg, Germany | C-29912 | |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type 2, Pathclear | R&D systems, Minneapolis, USA | 3533-005-02 | Alternative: Matrigel, Growth Factor Reduced Basement membrane matrix Corning, 356231 |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG | Jackson Immuno | 715-175-151 | |
| DAKO Citrate Buffer, pH 6.0, 10x Antigen Retriever | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | C9999-1000ML | |
| DAPI | Thermo Scientific, Waltham, USA | 62248 | |
| Donkey anti rabbit Alexa Fluor Plus 555 | Thermo Scientific, Waltham, USA | A32794 | |
| Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor Plus 488 | Thermo Scientific, Waltham, USA | A32814 | |
| Dulbecco´s Phosphate-Buffered Saline | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 14190-094 | |
| Epredia Richard-Allan Scientific HistoGel | Thermo Scientific, Waltham, USA | Epredia HG-4000-012 | |
| Falcon 24-well Polystyrene | Corning, Berlin, Germany | 351447 | |
| Feather scalpel | Pfm medical, Cologne, Germany | 200130010 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 10270106 | |
| Formalin 37% acid free, stabilized | Morphisto, Offenbach am Main, Germany | 1019205000 | |
| GlutaMAX | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 35050038 | |
| HEPES (1 M) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 156630080 | |
| Human EpCAM/TROP-1 Antibody | R&D systems, Minneapolis, USA | AF960 | |
| Human FGF10 | Peprotech, NJ, USA | 100-26 | |
| Human recombinant BMP2 | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | PHC7146 | |
| Human recombinant EGF | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | PHG0311L | |
| Human recombinant Heregulin beta-1 | Peprotech, NJ, USA | 100-03 | |
| LAS X core Software | Leica Microsystems | https://webshare.leica-microsystems.com/latest/core/widefield/ | |
| Leica TCS SP8 X White Light Laser Confocal Microscope | Leica Microsystems | ||
| N-2 Supplement (100x) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 17502-048 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | N0636 | |
| Omnifix 1 mL | Braun, Melsungen, Germany | 3570519 | |
| Paraffin | |||
| Parafilm | Omnilab, Munich, Germany | 5170002 | |
| Paraformaldehyd | Morphisto, Offenbach am Main, Germany | 1176201000 | |
| Pen Strep | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 15140-122 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | P4333-100 | |
| PluriStrainer 400 µm | PluriSelect, Leipzig, Germany | 43-50400-01 | |
| Primocin | InvivoGen, Toulouse, France | ant-pm-05 | |
| Red Blood Cell Lysing Buffer | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | 11814389001 | |
| Roticlear | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | A538.5 | |
| Surgipath Paraplast | Leica, Wetzlar, Germany | 39602012 | |
| Thermo Scientific Nunc Cryovials | Thermo Scientific, Waltham, USA | 375418PK | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | T8787 | |
| Trypan Blue Stain | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | T8154 | |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 12604-013 | |
| Tween-20 | PanReac AppliChem, Darmstadt, Germany | A4974-0100 | |
| Y-27632 | TOCRIS biotechne, Wiesbaden, Germany | 1254 | |
| Zeocin | Invitrogen, Thermo Scientific, Waltham, USA | R25001 |
Referências
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 72 (1), 7-33 (2022).
- Berger, A. C., et al. A comprehensive pan-cancer molecular study of gynecologic and breast cancers. Cancer Cell. 33 (4), 690-705 (2018).
- Watson, R. W. G., Kay, E. W., Smith, D. Integrating biobanks: addressing the practical and ethical issues to deliver a valuable tool for cancer research. Nat Rev Cancer. 10 (9), 646-651 (2010).
- Coppola, L., et al. Biobanking in health care: evolution and future directions. J Transl Med. 17 (1), 172 (2019).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nat Protoc. 11 (2), 347-358 (2016).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Hill, S. J., et al. Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids. Cancer Discov. 8 (11), 1404-1421 (2018).
- Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nat Med. 25 (5), 838-849 (2019).
- Larsen, B. M., et al. A pan-cancer organoid platform for precision medicine. Cell Rep. 36 (4), 109429 (2021).
- Bartfeld, S., Clevers, H. Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment. J Mol Med (Berl). 95 (7), 729-738 (2017).
- Larsen, B. M., Cancino, A., Shaxted, J. M., Salahudeen, A. A. Protocol for drug screening of patient-derived tumor organoids using high-content fluorescent imaging. STAR Protoc. 3 (2), 101407 (2022).
- Senkowski, W., et al. A platform for efficient establishment and drug-response profiling of high-grade serous ovarian cancer organoids. Dev Cell. 58 (12), 1106-1121 (2023).
- LeSavage, B. L., Suhar, R. A., Broguiere, N., Lutolf, M. P., Heilshorn, S. C. Next-generation cancer organoids. Nat Mater. 21 (2), 143-159 (2022).
- Hoffmann, K., et al. Stable expansion of high-grade serous ovarian cancer organoids requires a low-Wnt environment. EMBO J. 39 (6), e104013 (2020).
- Kessler, M., et al. The Notch and Wnt pathways regulate stemness and differentiation in human fallopian tube organoids. Nat Commun. 6, 8989 (2015).
- Trillsch, F., et al. Protocol to optimize the biobanking of ovarian cancer organoids by accommodating patient-specific differences in stemness potential. STAR Protoc. 4 (3), 102484 (2023).
- Maenhoudt, N., et al. Developing organoids from ovarian cancer as experimental and preclinical models. Stem Cell Reports. 14 (4), 717-729 (2020).
- Fuerer, C., Nusse, R. Lentiviral vectors to probe and manipulate the Wnt signaling pathway. PLoS One. 5 (2), e9370 (2010).
- . Leica ASP300S – Advanced smart processor vacuum tissue processor, instructions for use, V 2.1 Available from: https://www.leicabiosystems.com/sites/default/files/media_product-download/2022-01/Leica_ASP300S_IFU_2v1N_en.pdf (2021)
- Thermo Scientific. . Microm EC350 Modular tissue embedding center Instruction manual. , (2009).
- Nanki, Y., et al. Patient-derived ovarian cancer organoids capture the genomic profiles of primary tumours applicable for drug sensitivity and resistance testing. Sci Rep. 10 (1), 12581 (2020).
