Yumurtalık Kanseri Organoidlerinin Biyobankacılığı Stratejisi: Histolojik Alt Tipler ve Hastalık Evrelerinde Hastalar Arası Heterojenliğin Ele Alınması
Summary
Bu protokol, farklı hastalık evrelerinden yumurtalık kanseri organoidlerinin oluşturulması için sistematik bir çerçeve sunar ve verimi artırmak ve sonraki uygulamalar için sağlam uzun vadeli genişleme sağlamak için hastaya özgü değişkenliğin zorluklarını ele alır. Doku işleme, tohumlama, ortam gereksinimlerini ayarlama ve immünofloresan boyama için ayrıntılı adımlar içerir.
Abstract
Klinik arka plan bilgileriyle birlikte hasta kaynaklı organoidlerden bir yumurtalık kanseri biyobankasının kurulması, araştırma ve hasta bakımında ilerlemeler vaat ederken, organoid teknolojisinin doğal karmaşıklığı ile birlikte bu ölümcül malignitenin heterojenliği nedeniyle standardizasyon bir zorluk olmaya devam etmektedir. Bu uyarlanabilir protokol, progenitörlerin hastaya özgü değişkenliğini göz önünde bulundurarak yumurtalık kanseri organoidlerinin tam potansiyelini gerçekleştirmek için sistematik bir çerçeve sağlar. Optimum kültür koşullarını ve tohumlama yöntemlerini seçmek için yapılandırılmış bir deneysel iş akışı uygulayarak, 2D/3D rotaya karşı doğrudan 3D tohumlamanın paralel testini yaparak, çoğu durumda, çok çeşitli aşağı akış uygulamaları için uygun, sağlam, uzun vadeli genişleyen hatlar elde ediyoruz.
Özellikle, protokol, yüksek dereceli ve düşük dereceli yumurtalık kanseri ve primer debulking, tekrarlayan hastalık ve neoadjuvan sonrası cerrahi örnekler ile hastalığın evreleri dahil olmak üzere çok sayıda heterojen başlangıç materyali vakasında (N = 120) test edilmiş ve etkili olduğu kanıtlanmıştır. Düşük Wnt, yüksek BMP’li ekzojen sinyal ortamında, progenitörlerin Heregulin 1 ß (HERß-1) yolunun aktivasyonuna farklı şekilde duyarlı olduklarını, HERß-1’in bazılarında organoid oluşumunu teşvik ederken diğerlerinde inhibe ettiğini gözlemledik. Hastanın örneklerinin bir alt kümesi için, optimal organoid oluşumu ve uzun süreli büyüme, ortama fibroblast büyüme faktörü 10 ve R-Spondin 1’in eklenmesini gerektirir.
Ayrıca, doku sindirimi ve progenitör izolasyonunun kritik adımlarını vurguluyoruz ve plastik üzerinde 2D’de kısa ekilimin Bazal Membran Ekstraktı tip 2 matrisinde sonraki organoid oluşumu için faydalı olduğu örneklere işaret ediyoruz. Genel olarak, optimal biyobankacılık, bireysel hatlar için yeterli bir büyüme ortamını belirlemek için tüm ana koşulların paralel olarak sistematik olarak test edilmesini gerektirir. Protokol ayrıca, kapsamlı fenotipleme için gerekli olan organoidlerin yüksek çözünürlüklü görüntülerini elde etmek için verimli gömme, kesitleme ve boyama için işleme prosedürünü de açıklar.
Introduction
Epitelyal over kanserli hastaların ileri evrelerde heterojen klinik prezentasyonu ve yüksek nüks oranları nedeniyle klinik yönetimi zor olmaya devam etmektedir1. Yumurtalık kanseri gelişimi ve biyolojik davranışı hakkındaki anlayışımızı geliştirmek, hastalığın seyri sırasında hastaya özgü değişkenliği, tedavi yanıtını ve histopatolojik ve moleküler özellikleri ele alan araştırma yaklaşımlarını gerektirir2.
Yumurtalık kanseri hastalarından elde edilen tümör örneklerinin klinik bilgileriyle birlikte sistematik olarak toplanması ve uzun süreli korunması ile karakterize edilen biyobankacılık, primer debulking ameliyatlarından elde edilen tümör örnekleri, neoadjuvan kemoterapi sonrası ve tekrarlayan hastalıktan elde edilen tümör örnekleri de dahil olmak üzere farklı hastalık evrelerinde geniş bir hasta kohortunun korunmasını sağlar. Umut verici prognostik biyobelirteçler ve terapötik hedefler için bir kaynak olarak hizmet veren kanser araştırmalarını ilerletmek için değerli bir potansiyele sahiptir3. Bununla birlikte, formalin fiksasyonu ve dondurma gibi geleneksel biyobankacılık yöntemleri, canlılık kaybı ve doğal üç boyutlu doku mimarisinin bozulması nedeniyle orijinal tümör örnekleri üzerinde fonksiyonel çalışmalar yapmaya uygun değildir 4,5.
Onkoloji ve ötesinde moleküler mekanizmaların incelenmesi, hastalığın biyolojisini aslına uygun olarak yansıtan ve in vivo olarak gözlemlenen dokunun in vitro özelliklerini koruyan uygun deneysel modellerin kullanımına bağlıdır. Yenilenme potansiyelinin korunmasına dayanan hasta kaynaklı organoidler, laboratuvarda epitelin orijinal yapısını ve işlevini yeniden üretir ve hastaya özgü bir bağlamda test yapılmasına izin verir. Bu nedenle, kanser araştırmaları ve kişiselleştirilmiş tıp için son derece umut verici araçlar olarak ortaya çıkmışlar ve klinik çeşitlilik ile laboratuvar araştırmaları arasındaki boşluğu doldurmuşlardır 6,7,8,9. Organoid hatların bireysel ilaç yanıtlarına ve moleküler profillerin fonksiyonel uygunluğunun test edilmesine dayanan özel terapötik stratejiler, potansiyel olarak doğrudan hasta bakımına uygulanabilir10,11. Hastaya özgü özellikler de dahil olmak üzere uzun vadeli yetiştirme olasılığı ve zaman içinde ilgili prospektif klinik verilerin toplanması, hastalığın ilerlemesi ve direnç mekanizmalarında rol oynayan yeni prognostik ve öngörücü faktörlerin tanımlanması için büyük umut vaat etmektedir 3,9.
Bununla birlikte, farklı tümör örneklerinden organoidleri içeren bir biyobanka oluşturmak, karmaşık metodolojiye sıkı sıkıya bağlı kalmanın ve kolay bakım için protokoller oluşturmanın bir kombinasyonunu gerektirir12. Proses standardizasyonu, biyobankanın yüksek ciroda bile eğitimli personel tarafından verimli bir şekilde kurulmasını ve sürdürülebilmesini sağlarken aynı zamanda en yüksek kalite standartlarına bağlı kalınmasını sağlar13. Birkaç çalışma, orijinal tümörün mutasyonel ve fenotipik profiline karşılık gelen stabil yumurtalık kanseri organoid hatlarının değişen verimlilik oranlarıyla başarılı bir şekilde oluşturulduğunu bildirmiştir. Yine de, rutin biyo bankacılık, özellikle büyük ölçekli genişleme veya başarılı genomik düzenleme için bir ön koşul olan hatların uzun vadeli istikrarlı büyümesi için pratikte zorlu olmaya devam etmektedir.
Özellikle, yavaş ve sınırlı büyüme potansiyeli gösteren organoidler zaman zaman yerleşik hatlar olarak sayıldığından, genişletilebilirlik konusu sahada belirsiz bir şekilde tanımlanmaktadır. Başlangıçta Hoffmann ve ark. tarafından gösterildiği gibi, temel bulguları bu daha da geliştirilmiş protokolün temelini oluşturan bir çalışma, yumurtalık kanseri dokusunun optimal kullanımı, heterojenliği barındırmak için benzersiz bir strateji gerektirir14. Bu yöntemle elde edilen organoidlerin fenotipik karakterizasyonu ve ebeveyn tümör dokusu ile yakın benzerliği, panel DNA dizilemesi ve olgun kültürlerin transkriptomik analizi (4-10 aylık kültivasyon) ile doğrulandı ve model 8,9,12,14’ün stabilitesini gösterdi.
Sağlıklı fallop tüplerinde homeostazı düzenleyen parakrin ortamın aksine, muhtemelen yüksek dereceli seröz yumurtalık kanseri (HGSOC), kanser rejenerasyon potansiyeli ve organoid oluşum kapasitesi veren epitel tabakası, eksojen Wnt takviyesine daha az bağımlıdır. Ayrıca, organoid ortamda Noggin yokluğu ile karakterize edilen aktif Kemik Morfogenetik Proteini (BMP) sinyalinin, yumurtalık kanseri katı doku birikintilerinden uzun süreli kültürlerin kurulması için faydalı olduğu kanıtlanmıştır14,15. Yumurtalık kanserinin katı birikintilerinin sistematik biyobankacılığı sırasında, bu bulguları doğruladık ve vakaların çoğunda sürekli uzun vadeli genişleme sağlayan bu protokolde özetlenen ayrıntılarla boru hattını kurduk. Birincil izolatlarla çalışırken farklı ortam bileşimlerinin ve tohumlama modalitelerinin paralel testinin, uzun vadeli kararlı organoid hatlarının kurulmasını iyileştirmek ve verimi artırmak, aşağı akış deneyleri için gerekli olan çok kuyulu formatlara sağlam yayılma ve genişleme sağlamak için gerekli olduğunu bulduk16.
Ayrıca, ameliyat sırasında toplanan örneklerin saflığı ve kalitesi, temel araştırma ve moleküler tanıda yumurtalık kanseri organoidlerinin translasyon potansiyeli için çok önemlidir. HGSOC’nin klinik sunumunun karmaşıklığı, ilgili materyalin doğru bir şekilde tanımlanmasını, taşıma koşullarının sabit tutulmasını ve organoid hatlarının yüksek verimlilikle üretilmesini sağlamak için cerrahlar, onkologlar ve laboratuvardaki bilim adamları arasında yakın işbirliği gerektirir. Bu protokol, yumurtalık kanserini karakterize eden heterojenliği göz önünde bulundurarak, yumurtalık kanseri organoidlerinin tam potansiyelini yakalamak için standartlaştırılmış ancak uyarlanabilir bir çerçeve sağlar16,17. Özellikle, bu protokol, farklı histolojik tipler (yüksek dereceli ve düşük dereceli yumurtalık kanseri, LGSOC), kök regülasyonunda farklılıklar sergileyen aynı hastalardan farklı tortular, neoadjuvan sonrası ortamda ameliyatlardan alınan dokular, biyopsi materyali ve hastalık ilerlemesinin tekrarlayan fazındaki ameliyatlardan alınan örnekler dahil olmak üzere geniş yumurtalık kanseri klinik sunumunun geniş spektrumunun güvenilir biyobankacılığını sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tasarlanan protokol, organoid oluşumu ve uzun vadeli geçiş potansiyeli ile ilgili olarak yumurtalık kanseri organoid biyobankacılığının önceki zorluklarını ele alır ve katı tümör birikintilerinin çoğundan tamamen genişletilebilir hatların oluşturulmasını sağlar. Organoid üretimi için kullanılacak tümör örneklerinin cerrahi olarak toplanması süreci, verimi ve genişleme potansiyelini önemli ölçüde etkiler. Tümör dokusu örnekleri, çoklu viseral cerrahi, tanısal laparoskopi veya biyo…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Çalışma, DKFZ ve Münih Üniversite Hastanesi arasındaki bir ortaklık olan Alman Kanser Araştırma Merkezi DKTK, Ortak site Münih tarafından finanse edilmektedir. Çalışma aynı zamanda Alman Kanser Yardımı hibesi (#70113426 ve #70113433) tarafından da desteklenmektedir. Doku ve organoidlerin parafin gömülmesi, LMU Münih, Münih Tıp Fakültesi Anatomi Enstitüsü’nün Çekirdek tesisinde gerçekleştirilmiştir. Konfokal Görüntüleme, Biyomedikal Merkezi’ndeki (BMC) Biyogörüntüleme Çekirdek tesisinde gerçekleştirilmiştir. Yazarlar teknik yardım için Simone Hofmann, Maria Fischer, Cornelia Herbst, Sabine Fink ve Martina Rahmeh’e teşekkür etmek istiyor.
Materials
| 100 Sterican 26 G | Braun, Melsungen, Germany | 4657683 | |
| 100 Sterican 27 G | Braun, Melsungen, Germany | 4657705 | |
| 293T HA Rspo1-Fc | R&D systems, Minneapolis, USA | 3710-001-01 | Alternative: R-Spondin1 expressing Cell line, Sigma-Aldrich, SC111 |
| A-83-01 (TGF-b RI Kinase inhibitor IV) | Merck, Darmstadt, Germany | 616454 | |
| Advanced DMEM/F-12 Medium | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 12634028 | |
| Anti-p53 antibody (DO1) | Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA | sc-126 | |
| Anti-PAX8 antibody | Proteintech, Manchester, UK | 10336-1-AP | |
| B-27 Supplement (50x) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 17504-044 | |
| Bottle-top vacuum filter 0.2 µm | Corning, Berlin, Germany | 430049 | |
| CELLSTAR cell culture flask, 175 cm2 | Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria | 661175 | |
| CELLSTAR cell culture flask, 25 cm2 | Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria | 690160 | |
| CELLSTAR cell culture flask, 75 cm2 | Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria | 658175 | |
| Collagenase I | Thermo Scientific, Waltham, USA | 17018029 | |
| Costar 48-well Clear TC-treated | Corning, Berlin, Germany | 3548 | |
| Cryo SFM | PromoCell – Human Centered Science, Heidelberg, Germany | C-29912 | |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type 2, Pathclear | R&D systems, Minneapolis, USA | 3533-005-02 | Alternative: Matrigel, Growth Factor Reduced Basement membrane matrix Corning, 356231 |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG | Jackson Immuno | 715-175-151 | |
| DAKO Citrate Buffer, pH 6.0, 10x Antigen Retriever | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | C9999-1000ML | |
| DAPI | Thermo Scientific, Waltham, USA | 62248 | |
| Donkey anti rabbit Alexa Fluor Plus 555 | Thermo Scientific, Waltham, USA | A32794 | |
| Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor Plus 488 | Thermo Scientific, Waltham, USA | A32814 | |
| Dulbecco´s Phosphate-Buffered Saline | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 14190-094 | |
| Epredia Richard-Allan Scientific HistoGel | Thermo Scientific, Waltham, USA | Epredia HG-4000-012 | |
| Falcon 24-well Polystyrene | Corning, Berlin, Germany | 351447 | |
| Feather scalpel | Pfm medical, Cologne, Germany | 200130010 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 10270106 | |
| Formalin 37% acid free, stabilized | Morphisto, Offenbach am Main, Germany | 1019205000 | |
| GlutaMAX | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 35050038 | |
| HEPES (1 M) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 156630080 | |
| Human EpCAM/TROP-1 Antibody | R&D systems, Minneapolis, USA | AF960 | |
| Human FGF10 | Peprotech, NJ, USA | 100-26 | |
| Human recombinant BMP2 | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | PHC7146 | |
| Human recombinant EGF | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | PHG0311L | |
| Human recombinant Heregulin beta-1 | Peprotech, NJ, USA | 100-03 | |
| LAS X core Software | Leica Microsystems | https://webshare.leica-microsystems.com/latest/core/widefield/ | |
| Leica TCS SP8 X White Light Laser Confocal Microscope | Leica Microsystems | ||
| N-2 Supplement (100x) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 17502-048 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | N0636 | |
| Omnifix 1 mL | Braun, Melsungen, Germany | 3570519 | |
| Paraffin | |||
| Parafilm | Omnilab, Munich, Germany | 5170002 | |
| Paraformaldehyd | Morphisto, Offenbach am Main, Germany | 1176201000 | |
| Pen Strep | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 15140-122 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | P4333-100 | |
| PluriStrainer 400 µm | PluriSelect, Leipzig, Germany | 43-50400-01 | |
| Primocin | InvivoGen, Toulouse, France | ant-pm-05 | |
| Red Blood Cell Lysing Buffer | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | 11814389001 | |
| Roticlear | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | A538.5 | |
| Surgipath Paraplast | Leica, Wetzlar, Germany | 39602012 | |
| Thermo Scientific Nunc Cryovials | Thermo Scientific, Waltham, USA | 375418PK | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | T8787 | |
| Trypan Blue Stain | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | T8154 | |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 12604-013 | |
| Tween-20 | PanReac AppliChem, Darmstadt, Germany | A4974-0100 | |
| Y-27632 | TOCRIS biotechne, Wiesbaden, Germany | 1254 | |
| Zeocin | Invitrogen, Thermo Scientific, Waltham, USA | R25001 |
Referências
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 72 (1), 7-33 (2022).
- Berger, A. C., et al. A comprehensive pan-cancer molecular study of gynecologic and breast cancers. Cancer Cell. 33 (4), 690-705 (2018).
- Watson, R. W. G., Kay, E. W., Smith, D. Integrating biobanks: addressing the practical and ethical issues to deliver a valuable tool for cancer research. Nat Rev Cancer. 10 (9), 646-651 (2010).
- Coppola, L., et al. Biobanking in health care: evolution and future directions. J Transl Med. 17 (1), 172 (2019).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nat Protoc. 11 (2), 347-358 (2016).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Hill, S. J., et al. Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids. Cancer Discov. 8 (11), 1404-1421 (2018).
- Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nat Med. 25 (5), 838-849 (2019).
- Larsen, B. M., et al. A pan-cancer organoid platform for precision medicine. Cell Rep. 36 (4), 109429 (2021).
- Bartfeld, S., Clevers, H. Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment. J Mol Med (Berl). 95 (7), 729-738 (2017).
- Larsen, B. M., Cancino, A., Shaxted, J. M., Salahudeen, A. A. Protocol for drug screening of patient-derived tumor organoids using high-content fluorescent imaging. STAR Protoc. 3 (2), 101407 (2022).
- Senkowski, W., et al. A platform for efficient establishment and drug-response profiling of high-grade serous ovarian cancer organoids. Dev Cell. 58 (12), 1106-1121 (2023).
- LeSavage, B. L., Suhar, R. A., Broguiere, N., Lutolf, M. P., Heilshorn, S. C. Next-generation cancer organoids. Nat Mater. 21 (2), 143-159 (2022).
- Hoffmann, K., et al. Stable expansion of high-grade serous ovarian cancer organoids requires a low-Wnt environment. EMBO J. 39 (6), e104013 (2020).
- Kessler, M., et al. The Notch and Wnt pathways regulate stemness and differentiation in human fallopian tube organoids. Nat Commun. 6, 8989 (2015).
- Trillsch, F., et al. Protocol to optimize the biobanking of ovarian cancer organoids by accommodating patient-specific differences in stemness potential. STAR Protoc. 4 (3), 102484 (2023).
- Maenhoudt, N., et al. Developing organoids from ovarian cancer as experimental and preclinical models. Stem Cell Reports. 14 (4), 717-729 (2020).
- Fuerer, C., Nusse, R. Lentiviral vectors to probe and manipulate the Wnt signaling pathway. PLoS One. 5 (2), e9370 (2010).
- . Leica ASP300S – Advanced smart processor vacuum tissue processor, instructions for use, V 2.1 Available from: https://www.leicabiosystems.com/sites/default/files/media_product-download/2022-01/Leica_ASP300S_IFU_2v1N_en.pdf (2021)
- Thermo Scientific. . Microm EC350 Modular tissue embedding center Instruction manual. , (2009).
- Nanki, Y., et al. Patient-derived ovarian cancer organoids capture the genomic profiles of primary tumours applicable for drug sensitivity and resistance testing. Sci Rep. 10 (1), 12581 (2020).
