Fabricación de matriz de bazo descelularizada derivada de ratas
Summary
La matriz de bazo descelularizada (DSM) tiene aplicaciones prometedoras en el campo de la ingeniería de tejidos hepáticos. Este protocolo describe el procedimiento para preparar el DSM de rata, que incluye la recolección de bazo de rata, la descelularización de los mismos mediante perfusión y la evaluación del DSM resultante para confirmar sus características.
Abstract
El trasplante de hígado es el tratamiento primario para la enfermedad hepática en etapa terminal. Sin embargo, la escasez y la calidad inadecuada de los órganos de los donantes hacen necesario el desarrollo de terapias alternativas. Los hígados bioartificiales (BAL) que utilizan matriz hepática descelularizada (DLM) han surgido como soluciones prometedoras. Sin embargo, el abastecimiento de DLM adecuados sigue siendo un reto. Se ha explorado el uso de una matriz de bazo descelularizada (DSM) como base para las LBA, ofreciendo una alternativa fácilmente disponible. En este estudio, se recolectaron bazos de rata y se descelularizaron utilizando una combinación de ciclos de congelación-descongelación y perfusión con reactivos de descelularización. El protocolo preservó las microestructuras y componentes de la matriz extracelular (MEC) dentro del DSM. El proceso completo de descelularización duró aproximadamente 11 h, lo que dio como resultado un ECM intacto dentro del DSM. El análisis histológico confirmó la eliminación de componentes celulares conservando la estructura y composición de la MEC. El protocolo presentado proporciona un método integral para la obtención de DSM, ofreciendo aplicaciones potenciales en ingeniería de tejido hepático y terapia celular. Estos hallazgos contribuyen al desarrollo de enfoques alternativos para el tratamiento de la enfermedad hepática en etapa terminal.
Introduction
El trasplante hepático sigue siendo el único tratamiento definitivo para la enfermedad hepática terminal 1,2,3. Sin embargo, la escasez crítica y la disminución de la calidad de los órganos de los donantes han aumentado la necesidad de tratamientos alternativos4. En el ámbito de la medicina regenerativa, los hígados bioartificiales (BAL) que utilizan matriz hepática descelularizada (DLM) han surgido como soluciones prometedoras 5,6,7. El DLM conserva la estructura hepática original, incluida su intrincada red microvascular y los componentes de la MEC, lo que ofrece un andamio para crear BAL trasplantables que podrían aliviar las enfermedades hepáticas.
A pesar de la promesa, la adopción de esta tecnología se enfrenta a desafíos, especialmente en el abastecimiento de DLM adecuados. Los DLM derivados del ser humano son escasos, mientras que los de origen animal conllevan riesgos de transmisión de enfermedades y rechazo inmunológico. En un enfoque innovador, nuestra investigación ha explorado el uso de una matriz de bazo descelularizada (DSM) como base para las LBA 8,9,10,11. El bazo está más disponible en diversas situaciones médicas, como la hipertensión portal, la ruptura traumática, la púrpura trombocitopénica idiopática y la donación después de la muerte cardíaca. Por lo tanto, el bazo está más ampliamente disponible que el hígado para fines de investigación. Los pacientes que se han sometido a esplenectomías no sufren afecciones graves, lo que confirma aún más la prescindibilidad del bazo. El microambiente del bazo, particularmente la matriz extracelular y los sinusoides, es similar al del hígado. Esto hace que el bazo sea un órgano adecuado para la adhesión y proliferación celular en la investigación del trasplante de hepatocitos. Sobre la base de estos hallazgos, nuestras investigaciones anteriores han demostrado que los DSM comparten microestructuras y componentes comparables con los DLM y pueden apoyar la supervivencia y la función de los hepatocitos, incluida la producción de albúmina y urea. Además, se ha demostrado que los DSM mejoran la diferenciación hepática de las células madre mesenquimales de la médula ósea, lo que conduce a una funcionalidad mejorada y consistente.
Mediante el empleo de DSMs tratados con heparina, hemos diseñado BALs funcionales capaces de demostrar una anticoagulación efectiva a corto plazo y una compensación parcial de la función hepática11. En consecuencia, este DSM tridimensional es muy prometedor para el avance de la ingeniería de tejidos hepáticos y la terapia celular. En este trabajo, presentamos los métodos detallados de recolección de bazo de rata y preparación de DSM que preservan las microestructuras y componentes de la MEC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los LBA representan un enfoque eficaz para el tratamiento de la enfermedad hepática terminal, especialmente en los casos en que el trasplante hepático se ve obstaculizado por la escasez actual de órganos de donantes6. Una opción prometedora para la creación de BAL es la utilización de DLM, que preserva la MEC natural y la estructura vascular del hígado nativo. Sin embargo, la escasez de DLM humana y los riesgos potenciales de infección e inmunogenicidad asociados con la DLM animal plantean…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo contó con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82000624), el Programa de Investigación Básica de Ciencias Naturales de Shaanxi (2022JQ-899 y 2021JM-268), el Programa de Apoyo a la Capacidad de Innovación de la Provincia de Shaanxi (2023KJXX-030), el Plan Clave de Investigación y Desarrollo de la Provincia de Shaanxi, el Proyecto Conjunto Universitario-Proyecto Clave (2021GXLH-Z-047), la Fundación Institucional del Primer Hospital Afiliado de la Universidad de Xi’an Jiaotong (2021HL-42 y 2021HL-21).
Materials
| Anesthesia Machine | Harvard Apparatus | tabletop | animal anesthesia |
| bubble trap | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd. | pore diameter: 5 μm | prevent air bubbles |
| Buprenorphine | TIPR Pharmaceutical Responsible Co.,Ltd | an analgesic | |
| Hemostatic Forceps | Shanghai Medical Instruments Co., Ltd | J31020 | surgical tool |
| Heparinized Saline | SPH No.1 Biochemical & Pharmaceutical Co., LTD | prevent the formation of thrombosis | |
| Isoflurane | RWD life Science Co. | anesthetic:for the induction and maintenanceof anesthesia | |
| Penicillin-Streptomycin | Beyotime Biotechnology Co., Ltd. | C0222 | antibiotics in vitro to prevent microbial contamination |
| Peristaltic Pump | Baoding Longer Precision Pump Co., Ltd. | BT100-1L | |
| Phosphate-Buffered Saline | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | 4481228 | phosphoric acid buffer salt solution |
| Silicone Tube | Baoding Longer Precision Pump Co., Ltd. | 2.4×0.8mm | |
| Silk Suture | Yangzhou Jinhuan Medical Instrument Factory | 6-0 and 3-0 | ligate blood vessels |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | 151-21-3 | ionic detergent, dissolves both cell and nuclear membranes |
| Syringe Pump | Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd | BeneFusion SP5 | intravenous infusion |
| Triton X-100 | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | 9002-93-1 | non-ionic detergent, disrupts lipid-lipid, lipid-protein, and DNA-protein interactions |
| Venous Catheter | B. Braun Company | 24G | inserting the spleen artery |
Referências
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