Fabbricazione di matrice di milza decellularizzata derivata da ratti
Summary
La matrice decellularizzata della milza (DSM) ha applicazioni promettenti nel campo dell’ingegneria del tessuto epatico. Questo protocollo delinea la procedura per la preparazione del DSM di ratto, che include la raccolta della milza di ratto, la loro decellularizzazione attraverso la perfusione e la valutazione del DSM risultante per confermarne le caratteristiche.
Abstract
Il trapianto di fegato è il trattamento principale per la malattia epatica allo stadio terminale. Tuttavia, la carenza e l’inadeguata qualità degli organi dei donatori richiedono lo sviluppo di terapie alternative. I fegati bioartificiali (BAL) che utilizzano la matrice epatica decellularizzata (DLM) sono emersi come soluzioni promettenti. Tuttavia, l’approvvigionamento di DLM adatti rimane impegnativo. L’uso di una matrice di milza decellularizzata (DSM) è stato esplorato come base per i BAL, offrendo un’alternativa prontamente disponibile. In questo studio, la milza di ratto è stata raccolta e decellularizzata utilizzando una combinazione di cicli di congelamento-disgelo e perfusione con reagenti di decellularizzazione. Il protocollo ha preservato le microstrutture e i componenti della matrice extracellulare (ECM) all’interno del DSM. Il processo completo di decellularizzazione ha richiesto circa 11 ore, risultando in una ECM intatta all’interno del DSM. L’analisi istologica ha confermato la rimozione dei componenti cellulari mantenendo la struttura e la composizione della MEC. Il protocollo presentato fornisce un metodo completo per ottenere il DSM, offrendo potenziali applicazioni nell’ingegneria dei tessuti epatici e nella terapia cellulare. Questi risultati contribuiscono allo sviluppo di approcci alternativi per il trattamento della malattia epatica allo stadio terminale.
Introduction
Il trapianto di fegato rimane l’unico trattamento definitivo per la malattia epatica allo stadio terminale 1,2,3. Tuttavia, la carenza critica e il declino della qualità degli organi dei donatori hanno aumentato la necessità di trattamenti alternativi4. Nel regno della medicina rigenerativa, i fegati bioartificiali (BAL) che utilizzano la matrice epatica decellularizzata (DLM) sono emersi come soluzioni promettenti 5,6,7. Il DLM preserva la struttura epatica originale, compresa la sua intricata rete microvascolare e i componenti della MEC, offrendo un’impalcatura per la creazione di BAL trapiantabili che potrebbero potenzialmente alleviare le malattie del fegato.
Nonostante le promesse, l’adozione di questa tecnologia deve affrontare delle sfide, in particolare nell’approvvigionamento di DLM adatti. I DLM di origine umana scarseggiano, mentre quelli di origine animale comportano rischi di trasmissione di malattie e rigetto immunitario. In un approccio innovativo, la nostra ricerca ha esplorato l’uso di una matrice milza decellularizzata (DSM) come base per i BAL 8,9,10,11. La milza è più facilmente disponibile in varie situazioni mediche, come l’ipertensione portale, la rottura traumatica, la porpora trombocitopenica idiopatica e la donazione dopo morte cardiaca. Pertanto, le milze sono più ampiamente disponibili dei fegati per scopi di ricerca. I pazienti che hanno subito splenectomie non soffrono di condizioni gravi, confermando ulteriormente la dispensabilità della milza. Il microambiente della milza, in particolare la matrice extracellulare e le sinusoidi, è simile a quello del fegato. Ciò rende la milza un organo adatto per l’adesione e la proliferazione cellulare nella ricerca sul trapianto di epatociti. Sulla base di questi risultati, le nostre precedenti indagini hanno dimostrato che i DSM condividono microstrutture e componenti comparabili con i DLM e possono supportare la sopravvivenza e la funzione degli epatociti, inclusa la produzione di albumina e urea. Inoltre, è stato dimostrato che i DSM migliorano la differenziazione epatica delle cellule staminali mesenchimali del midollo osseo, portando a una funzionalità migliore e coerente.
Utilizzando DSM trattati con eparina, abbiamo ingegnerizzato BAL funzionali in grado di dimostrare un’efficace anticoagulazione a breve termine e una parziale compensazione della funzionalità epatica11. Di conseguenza, questo DSM tridimensionale è una promessa significativa per il progresso dell’ingegneria del tessuto epatico e della terapia cellulare. In questo lavoro, presentiamo i metodi dettagliati di raccolta della milza di ratto e preparazione del DSM che preservano le microstrutture e i componenti dell’ECM.
Protocol
Representative Results
Discussion
I BAL rappresentano un approccio efficace per il trattamento della malattia epatica allo stadio terminale, in particolare nei casi in cui il trapianto di fegato è ostacolato dall’attuale carenza di organi da donatore6. Un’opzione promettente per la creazione di BAL è l’utilizzo del DLM, che preserva la MEC naturale e la struttura vascolare del fegato nativo. Tuttavia, la scarsità di DLM umano e i potenziali rischi di infezione e immunogenicità associati al DLM animale pongono limitazioni signi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dalla National Natural Science Foundation of China (82000624), dal Programma di ricerca di base in scienze naturali dello Shaanxi (2022JQ-899 e 2021JM-268), dal Programma di supporto alle capacità di innovazione della provincia dello Shaanxi (2023KJXX-030), dal Piano di ricerca e sviluppo chiave della provincia dello Shaanxi, dal Progetto congiunto universitario-Progetto chiave (2021GXLH-Z-047), dalla Fondazione istituzionale del primo ospedale affiliato dell’Università di Xi’an Jiaotong (2021HL-42 e 2021HL-21).
Materials
| Anesthesia Machine | Harvard Apparatus | tabletop | animal anesthesia |
| bubble trap | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd. | pore diameter: 5 μm | prevent air bubbles |
| Buprenorphine | TIPR Pharmaceutical Responsible Co.,Ltd | an analgesic | |
| Hemostatic Forceps | Shanghai Medical Instruments Co., Ltd | J31020 | surgical tool |
| Heparinized Saline | SPH No.1 Biochemical & Pharmaceutical Co., LTD | prevent the formation of thrombosis | |
| Isoflurane | RWD life Science Co. | anesthetic:for the induction and maintenanceof anesthesia | |
| Penicillin-Streptomycin | Beyotime Biotechnology Co., Ltd. | C0222 | antibiotics in vitro to prevent microbial contamination |
| Peristaltic Pump | Baoding Longer Precision Pump Co., Ltd. | BT100-1L | |
| Phosphate-Buffered Saline | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | 4481228 | phosphoric acid buffer salt solution |
| Silicone Tube | Baoding Longer Precision Pump Co., Ltd. | 2.4×0.8mm | |
| Silk Suture | Yangzhou Jinhuan Medical Instrument Factory | 6-0 and 3-0 | ligate blood vessels |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | 151-21-3 | ionic detergent, dissolves both cell and nuclear membranes |
| Syringe Pump | Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd | BeneFusion SP5 | intravenous infusion |
| Triton X-100 | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | 9002-93-1 | non-ionic detergent, disrupts lipid-lipid, lipid-protein, and DNA-protein interactions |
| Venous Catheter | B. Braun Company | 24G | inserting the spleen artery |
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